Realtids-PCR - Versionshistorik

Magnus Thore: /* Kvalitativ och kvantitativ realtids-PCR analys */

2010-09-01T14:31:30Z

Kvalitativ och kvantitativ realtids-PCR analys

Magnus Thore: /* LUX primer */

2010-09-01T14:30:47Z

LUX primer

Magnus Thore: /* SYBR Green */

2010-09-01T14:29:59Z

SYBR Green

Magnus Thore: /* SYBR Green */

2010-09-01T14:29:10Z

SYBR Green

Magnus Thore: /* Molecular beacon-probe */

2010-09-01T14:28:26Z

Molecular beacon-probe

Magnus Thore: /* FRET-probe */

2010-09-01T14:27:43Z

FRET-probe

Magnus Thore: /* TaqMan-probe */

2010-09-01T14:26:27Z

TaqMan-probe

Magnus Thore: /* TaqMan-probe */

2010-09-01T14:26:05Z

TaqMan-probe

Magnus Thore: /* Kvalitativ och kvantitativ realtids-PCR analys */

2010-09-01T13:48:11Z

Kvalitativ och kvantitativ realtids-PCR analys

Magnus Thore: /* LUX primer */

2010-09-01T13:47:49Z

LUX primer

@@ Rad 66: / Rad 66: @@
 ''Kvantitativ realtids-PCR'' bygger på att man har en hög effektivitet i PCR-reaktionen vilket kan beräknas enligt formeln 1/log (effektivitet) = cykel/log [DNA]. Vid effektiviteten 2.0 dvs 100 % så ökar cykeltalet med 3.32 cykler vid en spädningsserie på 1:10. Effektiviteten minskar oftast vid höga Ct-värden när färre starttemplat finns tillgängliga för PCR-reaktionen. Därför begränsar man ofta den kvantitativa realtids-PCR till ett område där effektiviteten är hög och med det en större säkerhet i svaret. Värden utanför området tillskriver man mer än eller mindre än metodens mätbara antal kopior/mL.
-[[Fil:molekylfig15.jpg]]
+[[Fil:molekylfig15.jpg|thumb|center|600px||'''Figur 15'''. Amplifierningskurva. När amplifieringskurvan passerar tröskeln kan man avläsa cykeltröskelvärdet (Ct-värdet) för en positiv PCR-reaktion. När man jämför Ct-värden innebär ett lägre Ct-värde att det finns mer starttemplat, DNA/RNA, i provet jämfört med ett Ct-värde som är högre. ''Bild: Fredrik Aronsson'']]
-'''Figur 15'''. Amplifierningskurva. När amplifieringskurvan passerar tröskeln kan man avläsa cykeltröskelvärdet (Ct-värdet) för en positiv PCR-reaktion. När man jämför Ct-värden innebär ett lägre Ct-värde att det finns mer starttemplat, DNA/RNA, i provet jämfört med ett Ct-värde som är högre. ''Bild: Fredrik Aronsson''
 [[Kategori:Molekylärbiologisk diagnostik]]

← Äldre version		Versionen från 1 september 2010 kl. 14.30
Rad 56:		Rad 56:


−	[[Fil:molekylfig14.jpg]]	+	[[Fil:molekylfig14.jpg\|thumb\|center\|600px\|\|\|\|'''Figur 14'''. LUX primer. Principen för LUX primer är att den i sin ursprungsform, hårnål, avger lite energi medan inbundet som dubbelsträngat DNA avger mycket energi. Ju fler amplikon som LUX primern inkorporerats i desto mer energi kan detekteras i PCR-instrumentet. ''Bild: Invitrogen, publicerad med tillstånd från företaget''.]]
−
−	'''Figur 14'''. LUX primer. Principen för LUX primer är att den i sin ursprungsform, hårnål, avger lite energi medan inbundet som dubbelsträngat DNA avger mycket energi. Ju fler amplikon som LUX primern inkorporerats i desto mer energi kan detekteras i PCR-instrumentet. ''Bild: Invitrogen, publicerad med tillstånd från företaget''.

	== Kvalitativ och kvantitativ realtids-PCR analys ==		== Kvalitativ och kvantitativ realtids-PCR analys ==

@@ Rad 49: / Rad 49: @@
 High-resolution melting, HRM, är en utveckling av smältpunktsanalys där man kan få fram mer detaljerad information om amplikonets sammansättning. Metoden används för att upptäcka genetiska variationer som tex SNP (singel nucleotide polymorphism) och mutationer vilket medför att ett användningsområde är typning av bakterier och virus. Man kan även använda tekniken till att upptäcka nya, okända varianter, sk gene scanning. Metoden upptäcker en blandning av olika amplikon med en liten skillnad i bas-sammansättningen (tex SNP) vilket visas som högupplösta smältkurvor. Mängdförhållandet mellan olika amplikon kan också skilja mycket men framkommer i analysen. Metoden kräver PCR-maskiner med analysprogram utvecklade för HRM. SYBR Green fungerar till viss del som analysfärg men det finns specifikt utvecklade färger för HRM-analys, exempelvis Eva Green, LC Green och ResoLight. HRM är kostnadsmässigt en billigare metod än probetekniken.
-[[Fil:molekylfig13.jpg]]
+[[Fil:molekylfig13.jpg|thumb|center|600px||'''Figur 13.''' Smältanalys. (A) Vid låg temperatur är all SYBR Green I inbundet till intakt dubbelsträngat DNA och mycket fluorescens kan detekteras. (B) Smältpunkten (Tm) för PCR-produkten är när hälften av DNA-strängarna separerats och hälften av SYBR Green I molekylerna är i fri form. Detta illustreras i den nedre kurvan (negativa derivatan av den övre kurvan) som en topp, smälttopp. (C) Alla DNA-strängar är separerade och ingen energi avges från SYBR Green I. ''Bild: Fredrik Aronsson'']]
 === LUX primer ===

← Äldre version		Versionen från 1 september 2010 kl. 14.29
Rad 42:		Rad 42:


−	[[Fil:molekylfig12.jpg]]	+	[[Fil:molekylfig12.jpg\|thumb\|center\|500px\|\|\|'''Figur 12'''. SYBR Green. Principen för SYBR Green I baserad detektion är att ju mer SYBR Green I som binder in till dubbelsträngat DNA ju mer emissionsenergi avges. ''Bild: © QIAGEN, all rights reserved'']]

−	'''Figur 12'''. SYBR Green. Principen för SYBR Green I baserad detektion är att ju mer SYBR Green I som binder in till dubbelsträngat DNA ju mer emissionsenergi avges. ''Bild: © QIAGEN, all rights reserved''
−

	Efter avslutad amplifiering utförs i realtids-PCR-instrumentet en smältpunktsanalys som kan skilja mellan amplikonet och eventuella biprodukter ('''figur 13'''). Smältpunkten hos dubbelsträngat DNA beror på sekvensens längd och nukleinsyrasammansättningen vilket gör varje amplikon specifikt gällande smältpunkt. Smältpunktsanalys utförs genom att temperaturen gradvis ökas med några tiondels grader per sekund och fluorescensen mäts kontinuerligt. Smältpunkten definieras som den temperatur där hälften av DNA-strängarna har separerats och därmed hälften av SYBR Green I molekylerna lossnat från DNA. Detta kan förtydligas med beräkning av den negativa derivatan av funktionen fluorescensintensitet mot temperaturen där smältpunkten motsvarar en topp i diagrammet. Ett sätt att öka specificiteten hos SYBR Green I under en PCR-reaktion är att utföra mätning av emissionsenergin vid en temperatur (Tmätning) som är under smältpunkten för amplikonet (TmPCR-produkt) men högre än smältpunkten för tex primer-dimer (Tmprimer-dimer) enligt följande Tmprimer-dimer <Tmätning < TmPCR-produkt. Det man uppnår är att man mäter amplifiering av endast amplikonet och inte summan av biprodukt plus amplikon. En tumregel är att Tmätning ligger ungefär 5°C under TmPCR-produkt. Smältpunktsanalys kan också genomföras med hydrolysprober som FRET-probe och molecular beacon-probe där varje probes smältpunkt är specifik och man kan skilja på olika prober i samma PCR-reaktion, vid tex multiplex PCR.		Efter avslutad amplifiering utförs i realtids-PCR-instrumentet en smältpunktsanalys som kan skilja mellan amplikonet och eventuella biprodukter ('''figur 13'''). Smältpunkten hos dubbelsträngat DNA beror på sekvensens längd och nukleinsyrasammansättningen vilket gör varje amplikon specifikt gällande smältpunkt. Smältpunktsanalys utförs genom att temperaturen gradvis ökas med några tiondels grader per sekund och fluorescensen mäts kontinuerligt. Smältpunkten definieras som den temperatur där hälften av DNA-strängarna har separerats och därmed hälften av SYBR Green I molekylerna lossnat från DNA. Detta kan förtydligas med beräkning av den negativa derivatan av funktionen fluorescensintensitet mot temperaturen där smältpunkten motsvarar en topp i diagrammet. Ett sätt att öka specificiteten hos SYBR Green I under en PCR-reaktion är att utföra mätning av emissionsenergin vid en temperatur (Tmätning) som är under smältpunkten för amplikonet (TmPCR-produkt) men högre än smältpunkten för tex primer-dimer (Tmprimer-dimer) enligt följande Tmprimer-dimer <Tmätning < TmPCR-produkt. Det man uppnår är att man mäter amplifiering av endast amplikonet och inte summan av biprodukt plus amplikon. En tumregel är att Tmätning ligger ungefär 5°C under TmPCR-produkt. Smältpunktsanalys kan också genomföras med hydrolysprober som FRET-probe och molecular beacon-probe där varje probes smältpunkt är specifik och man kan skilja på olika prober i samma PCR-reaktion, vid tex multiplex PCR.

@@ Rad 33: / Rad 33: @@
 ''Molecular beacon-probe'' (beacon betyder fyr) är ett  annat exempel på hybridiseringsprobe. Proben har två specifika strukturella former, en stam och en ögla ('''figur 11'''). Stamstrukturen hålles samman genom hybridisering då kvävebaserna är så valda att de basparar till varandra i fri lösning. Vardera 5’- respektive 3’-ändarna är inmärkta med en reporterfluorofor respektive quencher. Specificiteten för molecular beacon-proben ligger i öglans nukleinsyrasekvens vilken är komplementär till mål-DNA. Under PCR-reaktionen smälter stamstrukturen isär och om öglestrukturen hybridiserar till mål-DNA separeras reporter och quencher fysiskt. Därvid exiteras reportern dess emissionsenergi tas upp av detektorn i realtids-PCR-maskinen. På samma sätt som FRET-probe kan den återanvändas efter denaturering.
-[[Fil:molekylfig11.jpg]]
+[[Fil:molekylfig11.jpg|thumb|center|500px||'''Figur 11'''. Molecular beacon-probe. (A) Molecular beacon-probe i fri form är reporter (fluorofor) och quencher nära varandra och all energi från fluoroforen tas upp av quenchern. (B) När proben bundit till templatet skiljs fluorofor och quencher åt så fluoroforens emissionsenergi kan detekteras av PCR-instrumentet. (C) När proben avlägsnas återgår den till sitt ursprung i form av en hårnåls struktur. ''Bild: © QIAGEN, all rights reserved'']]
 === SYBR Green ===

@@ Rad 27: / Rad 27: @@
 Första exemplet på en hybridiseringsprobe är ''Fluorescence Resonance Energy Transfer''-probe som förkortas ''FRET''-probe. Den består av två oligonukleotider inmärkta med varsin fluorofor men med olika excitations- och emissionsspektra. Proberna är designade så att de hybridiserar, binder in, till mål-DNA med endast några basers mellanrum. Den första probens fluorofor är inmärkt i probens 3’-ände och kallas donatorfluorofor. Den andre probens fluorofor är inmärkt i dess 5’-ände och kallas mottagarfluorofor. Principen för detektion är att proberna binder in till mål-DNA och donatorfluoroforen exiteras av realtids-PCR-instrumentet, dess emissionsenergi överförs till mottagarfluoroforen som blir exiterad och en tredje energi frigörs från mottagarfluoroforen som tas upp av detektorn i realtids-PCR-instrumentet ('''figur 10'''). Denna energiövergång fungerar inte i fri lösning då proberna inte är hybridiserade nära varandra. I PCR-reaktionens denatureringsfas smälter, lossnar, proberna från mål-DNA och kan återanvändas, till skillnad från en TaqMan-probe som hydrolyseras. Efter PCR-reaktionen kan man utföra en smältanalys för att få fram smältvärdet för proberna till amplikonet. Man kan utnyttja smältanalysen för att särskilja olika genotyper som exempel för [[adenovirus]]. I detta exempel amplifieras och detekteras både serotyp 40 och 41 av samma primerpar och prober men vid smältanalys får de olika värden beroende på serotyp. Detta beror på att proberna binder olika hårt till de två serotypamplikonen då en av serotyperna har en eller flera mis-match där proben hybridiserar dvs binder.
-[[Fil:molekylfig10.jpg]]
+[[Fil:molekylfig10.jpg|thumb|center|500px||'''Figur 10'''. FRET-probe. (A) Donatorproben i fri form avger energi medan mottagarproben (acceptor) inte avger någon energi. (B) Under annealingsteget binder båda prober in och energin från donatorproben överförs till mottagarproben som exiteras och vars emissionsenergi kan detekteras i PCR-instrumentet. (C) När proberna avlägsnas sker ingen energiöverföring mellan proberna och signalen släcks ned. ''Bild: © QIAGEN, all rights reserved'']]
 === Molecular beacon-probe ===

@@ Rad 21: / Rad 21: @@
 Den vanligaste typen av hydrolysprobe är ''TaqMan''-probe. Den är i sin 5’-ände inmärkt med en fluorofor, en så kallad reporter och i sin 3’-ände inmärkt med en quencher. Vid amplifiering binder proben in till mål-DNA och under elongeringsfasen hydrolyseras proben, bryts ned, av Taq-polymerasets 5’-exonukleas aktivitet varvid reporter och quencher skiljs åt ('''figur 9'''). Energin från den fria och exciterade reportern absorberas inte längre av quenchern utan tas nu upp av detektorn i realtids-PCR-instrumentet. Specificiteten för en TaqMan-probe kan ökas genom att man i 3’-änden fäster en så kallad ''minorgroove binder'' (MGB)-molekyl. PCR-reaktionen blir nu mer robust då MGB-molekylen binder hårdare till DNA-molekylen, vilket innebär att probens smältvärde (Tm) ökar. Hydrolysprober fungerar bäst vid tvåstegs-PCR, vilket innebär att annealing och elongeringsfaserna slås samman till en fas i PCR-reaktionen.
-[[Fil:molekylfig9.jpg|thumb|left|500px|||'''Figur 9'''. TaqMan-probe. (A) Principen för en TaqMan-probe är att probe och primer binder in till templatet där en intakt probe inte avger någon emissionsenergi. (B) Vid elongering avlägsnas fluoroforen (reporter) vilket medför att man kan mäta energin från den fria fluoroforen.  ''Bild: © QIAGEN, all rights reserved'']]
+[[Fil:molekylfig9.jpg|thumb|center|500px|||'''Figur 9'''. TaqMan-probe. (A) Principen för en TaqMan-probe är att probe och primer binder in till templatet där en intakt probe inte avger någon emissionsenergi. (B) Vid elongering avlägsnas fluoroforen (reporter) vilket medför att man kan mäta energin från den fria fluoroforen.  ''Bild: © QIAGEN, all rights reserved'']]
 === FRET-probe ===

← Äldre version		Versionen från 1 september 2010 kl. 13.48
Rad 77:		Rad 77:

	''Kvantitativ realtids-PCR'' bygger på att man har en hög effektivitet i PCR-reaktionen vilket kan beräknas enligt formeln 1/log (effektivitet) = cykel/log [DNA]. Vid effektiviteten 2.0 dvs 100 % så ökar cykeltalet med 3.32 cykler vid en spädningsserie på 1:10. Effektiviteten minskar oftast vid höga Ct-värden när färre starttemplat finns tillgängliga för PCR-reaktionen. Därför begränsar man ofta den kvantitativa realtids-PCR till ett område där effektiviteten är hög och med det en större säkerhet i svaret. Värden utanför området tillskriver man mer än eller mindre än metodens mätbara antal kopior/mL.		''Kvantitativ realtids-PCR'' bygger på att man har en hög effektivitet i PCR-reaktionen vilket kan beräknas enligt formeln 1/log (effektivitet) = cykel/log [DNA]. Vid effektiviteten 2.0 dvs 100 % så ökar cykeltalet med 3.32 cykler vid en spädningsserie på 1:10. Effektiviteten minskar oftast vid höga Ct-värden när färre starttemplat finns tillgängliga för PCR-reaktionen. Därför begränsar man ofta den kvantitativa realtids-PCR till ett område där effektiviteten är hög och med det en större säkerhet i svaret. Värden utanför området tillskriver man mer än eller mindre än metodens mätbara antal kopior/mL.
		+
		+	[[Fil:molekylfig15.jpg]]

	'''Figur 15'''. Amplifierningskurva. När amplifieringskurvan passerar tröskeln kan man avläsa cykeltröskelvärdet (Ct-värdet) för en positiv PCR-reaktion. När man jämför Ct-värden innebär ett lägre Ct-värde att det finns mer starttemplat, DNA/RNA, i provet jämfört med ett Ct-värde som är högre. ''Bild: Fredrik Aronsson''		'''Figur 15'''. Amplifierningskurva. När amplifieringskurvan passerar tröskeln kan man avläsa cykeltröskelvärdet (Ct-värdet) för en positiv PCR-reaktion. När man jämför Ct-värden innebär ett lägre Ct-värde att det finns mer starttemplat, DNA/RNA, i provet jämfört med ett Ct-värde som är högre. ''Bild: Fredrik Aronsson''

@@ Rad 66: / Rad 66: @@
+[[Fil:molekylfig14.jpg]]
-Figur 14. LUX primer. Principen för LUX primer är att den i sin ursprungsform, hårnål, avger lite energi medan inbundet som dubbelsträngat DNA avger mycket energi. Ju fler amplikon som LUX primern inkorporerats i desto mer energi kan detekteras i PCR-instrumentet. ''Bild: Invitrogen, publicerad med tillstånd från företaget''.
+'''Figur 14'''. LUX primer. Principen för LUX primer är att den i sin ursprungsform, hårnål, avger lite energi medan inbundet som dubbelsträngat DNA avger mycket energi. Ju fler amplikon som LUX primern inkorporerats i desto mer energi kan detekteras i PCR-instrumentet. ''Bild: Invitrogen, publicerad med tillstånd från företaget''.
 == Kvalitativ och kvantitativ realtids-PCR analys ==