Skillnad mellan versioner av "PAR 10 Odling av Acanthamoeba"
Hoppa till navigering
Hoppa till sök
(Skapade sidan med ' Odling av Acanthamoeba på non-nutrient agar Analysprincip Anrikning av Acanthamoeba från patientprov genom odling på non-nutrient agarplatta täckt med E. coli K12 bakterie...') |
|||
| (34 mellanliggande sidversioner av samma användare visas inte) | |||
| Rad 1: | Rad 1: | ||
| + | '''Huvudartikel''', publicerad mars 2012. | ||
| − | Odling av Acanthamoeba på non-nutrient agar | + | ----- |
| − | Analysprincip | + | ''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik]] '' |
| − | Anrikning av Acanthamoeba från patientprov genom odling på non-nutrient agarplatta täckt med E. coli K12 bakterier som föda. Enstaka cystor som kan finnas i materialet excysterar och trofozoiter förökar sig och utvecklas så småningom till karakteristiska cystor som identifieras mikroskopiskt. | + | ---- |
| − | Reagenser | + | |
| − | Page´s saltlösning, steril | + | ==Odling av ''Acanthamoeba'' på non-nutrient agar== |
| − | Lösning | + | ===Analysprincip=== |
| − | + | Anrikning av ''Acanthamoeba'' från patientprov genom odling på non-nutrient agarplatta täckt med ''E. coli'' K12 bakterier som föda. Enstaka cystor som kan finnas i materialet excysterar och trofozoiter förökar sig och utvecklas så småningom till karakteristiska cystor som identifieras mikroskopiskt. | |
| − | + | ===Reagenser=== | |
| − | destillerat vatten | + | ''' Page´s saltlösning''', steril |
| − | Autoklavera, 20 min, 121ºC | + | |
| − | Lösning | + | ''Lösning 1'' |
| − | + | ||
| − | + | :Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 2.84 g | |
| − | NaCl | + | :KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 2.72 g |
| − | destillerat vatten | + | :destillerat vatten 500 ml |
| − | Autoklavera, 20 min, 121ºC | + | :Autoklavera, 20 min, 121ºC |
| − | Låt kallna till rumstemperatur, blanda lösning 1 och 2 | + | ''Lösning 2'' |
| − | Förvaring: kylskåp | + | |
| − | Blodagar plattor | + | :MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O 8.0 g |
| − | Förvaring: kylskåp | + | :CaCl<sub>2</sub> 2 H<sub>2</sub>O 8.0 g |
| − | Hållbarhet: ca 4 veckor | + | :NaCl 0. 240 g |
| − | E. coli K12 kultur | + | :destillerat vatten 500 ml |
| − | Förvaring: kylskåp | + | :Autoklavera, 20 min, 121ºC. Låt kallna till rumstemperatur, blanda lösning 1 och 2. |
| − | Hållbarhet: ca 4 veckor | + | :Förvaring: kylskåp |
| − | Non-nutrient agar i rör, steril | + | '''Blodagar plattor''' |
| − | + | ||
| − | + | :Förvaring: kylskåp | |
| − | Autoklavera, 20 min, 121 ºC. Portionera i sterila rör (20 ml/ rör) | + | :Hållbarhet: ca 4 veckor |
| − | Positiv kontroll | + | ''' ''E. coli'' K12 kultur''' |
| − | Acanthamoeba | + | |
| − | Förvaring: kylskåp | + | :Förvaring: kylskåp |
| − | Hållbarhet: flera månader, så länge agarn ej är intorkad. | + | :Hållbarhet: ca 4 veckor |
| − | + | '''Non-nutrient agar i rör, steril''' | |
| − | Analysprocedur | + | |
| + | :agar utan tillsatser 15g | ||
| + | :destillerat vatten, eller PBS eller Page´s saltlösning 1 000 ml | ||
| + | :Autoklavera, 20 min, 121 ºC. Portionera i sterila rör (20 ml/ rör) | ||
| + | |||
| + | '''Positiv kontroll: ''Acanthamoeba'' spp. kultur'''. | ||
| + | |||
| + | :Förvaring: kylskåp | ||
| + | :Hållbarhet: flera månader, så länge agarn ej är intorkad. | ||
| + | |||
| + | ===Analysprocedur=== | ||
Arbetet utförs i säkerhetsbänk. Handskar används genomgående. | Arbetet utförs i säkerhetsbänk. Handskar används genomgående. | ||
| + | ====Förberedelser==== | ||
| + | A. Subkultivering av ''E. coli'' (1-2 dagar innan analysdag, äldre bakterier fungerar också). | ||
| + | |||
| + | # Stryk ut ''E. coli'' K12 på en ny blodagar platta. | ||
| + | # Inkubera plattorna upp och ned, minst 1 dygn, i 30 °C. | ||
| + | |||
| + | B. Gjutning av agarplattor (kan göras samma dag eller i förväg) | ||
| + | |||
| + | # Beräkna en agarplatta per provmaterial, plus en platta till positiva kontrollen. Till varje platta åtgår ett rör med non-nutrient agar. | ||
| + | # Smält non-nutrient agar i kokande vattenbad. | ||
| + | # Häll den smälta agarn i en petriskål och låt den stelna. | ||
| + | # Förvara förgjutna plattor till analysdag i kylskåp. | ||
| + | # Plattor inpackade i parafilm kan förvaras i en månad. | ||
| + | ====Analysdag==== | ||
| + | 1. Rumstemperera agarplattorna | ||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
2. Häll ca 0,5 mL Page´s saltlösning på blodagarplattan och slamma upp lite kolibakterier med en 10 µL bakteriologisk ögla. Tillsätt 3-4 droppar bakterie-suspension mitt på varje nonnutrient agarplatta. Sprid ut bakterierna med en 10 µL bakteriologisk ögla. Obs! Bakterielagret får inte vara flytande (låt överflödig vätska absorberas in i plattan). | 2. Häll ca 0,5 mL Page´s saltlösning på blodagarplattan och slamma upp lite kolibakterier med en 10 µL bakteriologisk ögla. Tillsätt 3-4 droppar bakterie-suspension mitt på varje nonnutrient agarplatta. Sprid ut bakterierna med en 10 µL bakteriologisk ögla. Obs! Bakterielagret får inte vara flytande (låt överflödig vätska absorberas in i plattan). | ||
| + | |||
3. Märk plattorna med analysdatum och provnummer. Märk också en platta för positiv kontroll och sätt undan till punkt 8. | 3. Märk plattorna med analysdatum och provnummer. Märk också en platta för positiv kontroll och sätt undan till punkt 8. | ||
| − | 4. | + | |
| − | + | 4. Lägg provmaterial på plattan: | |
| − | + | :* Linsvätska centrifugeras först 500 x g, 5 min. Supernatanten sugs av och sedimentet inokuleras på plattan. | |
| − | + | ||
| − | + | :* Rör med biopsimaterial i transportmedium centrifugeras 500 x g, 5 min och supernatanten sugs av. Vävnadsbiopsi samt sediment inokuleras i mitten av plattan. Försök att undvikaöverflödig vätska! | |
| + | :* Kontaktlinser placeras i mitten av plattan. | ||
| + | |||
5. Inkubera plattorna upp och ned i 30 °C i fuktkammare (plastpåse med en liten bit fuktad pappershandduk). | 5. Inkubera plattorna upp och ned i 30 °C i fuktkammare (plastpåse med en liten bit fuktad pappershandduk). | ||
| + | |||
6. Tvätta arbetsytan med 70 % sprit. | 6. Tvätta arbetsytan med 70 % sprit. | ||
| + | |||
7. Byt handskar. | 7. Byt handskar. | ||
| − | 8. Skär en ca 1 | + | |
| + | 8. Skär en ca 1 cm<sup>2</sup> stor agarbit från platta med uppodlad referensstam av ''Acanthamoeba''. Notera stamidentitet i analysprotokollet. Placera agarbiten upp och ned i mitten av plattan märkt positiv kontroll. | ||
| + | |||
9. Inkubera plattan upp och ned i 30 °C i separat fuktkammare. | 9. Inkubera plattan upp och ned i 30 °C i separat fuktkammare. | ||
| + | |||
10. Inkubera alla plattor i en vecka. | 10. Inkubera alla plattor i en vecka. | ||
| − | Avläsning och bedömning. | + | |
| + | ====Avläsning och bedömning.==== | ||
Varje arbetsdag granskas hela plattan i inverterat mikroskop. Leta efter cystor och/eller trofozoiter. Börja varje avläsning med patientprov, tvätta därefter mikroskopbordet, byt handskar och kontrollera referenskulturen. | Varje arbetsdag granskas hela plattan i inverterat mikroskop. Leta efter cystor och/eller trofozoiter. Börja varje avläsning med patientprov, tvätta därefter mikroskopbordet, byt handskar och kontrollera referenskulturen. | ||
| − | Gör ett utstryk eller imprint av kulturen vid positivt fynd i patientprov. Låt preparaten lufttorka. För färgning med Giemsa se bilaga | + | Gör ett utstryk eller imprint av kulturen vid positivt fynd i patientprov. Låt preparaten lufttorka. För färgning med Giemsa se bilaga [[PAR 09 Malariamikroskopi|PAR 09 ]]. |
| − | Kriterier för identifiering av Acanthamoeba spp. | + | =====Kriterier för identifiering av ''Acanthamoeba'' spp.===== |
Trofozoiter kan variera mellan 20–40 µm i diameter och kan ha olika former. | Trofozoiter kan variera mellan 20–40 µm i diameter och kan ha olika former. | ||
Direktmikroskopi: Levande trofozoiter har en vakuol som tömmer sig flera gånger per minut. Cystorna, 12–18 µm i diameter, är polygonala, har dubbla väggar och ser ut som kristaller. | Direktmikroskopi: Levande trofozoiter har en vakuol som tömmer sig flera gånger per minut. Cystorna, 12–18 µm i diameter, är polygonala, har dubbla väggar och ser ut som kristaller. | ||
Giemsafärgning: Cytoplasman i färgade trofozoiter innehåller flera vakuoler och har en centralt placerad kärna med en stor endosom (ref. 3). | Giemsafärgning: Cytoplasman i färgade trofozoiter innehåller flera vakuoler och har en centralt placerad kärna med en stor endosom (ref. 3). | ||
| − | Svarsrutin | + | |
| − | Växt av trofozoiter och/eller cystor av Acanthamoeba spp. påvisade i odling. | + | ====Svarsrutin==== |
| − | Ingen växt av Acanthamoeba spp. i odling. | + | Växt av trofozoiter och/eller cystor av ''Acanthamoeba'' spp. påvisade i odling. |
| − | Kvalitetssäkring | + | |
| + | Ingen växt av ''Acanthamoeba'' spp. i odling. | ||
| + | ====Kvalitetssäkring==== | ||
Intern: Referensstam odlas samtidigt med proverna. | Intern: Referensstam odlas samtidigt med proverna. | ||
Extern: saknas | Extern: saknas | ||
| − | Prestanda | + | ====Prestanda==== |
| − | Negativt fynd utesluter ej Acanthamoeba spp.- infektion. | + | Negativt fynd utesluter ej ''Acanthamoeba'' spp.- infektion. |
Sensitivitet: är i genomsnitt 76 % för odling av ögonskrap. Högre sensitivitet kan fås vid odling av djup biopsi från hornhinnan (ref. 2). | Sensitivitet: är i genomsnitt 76 % för odling av ögonskrap. Högre sensitivitet kan fås vid odling av djup biopsi från hornhinnan (ref. 2). | ||
Specificitet: vid mikroskopisk påvisning kan endast genus anges. | Specificitet: vid mikroskopisk påvisning kan endast genus anges. | ||
| − | Säkerhetsaspekter och avfallshantering | + | ====Säkerhetsaspekter och avfallshantering==== |
| − | Acanthamoeba spp tillhör skyddsklass 2 patogener. Både cystor och trofozoiter kan vara infektiösa för människor. | + | ''Acanthamoeba'' spp tillhör skyddsklass 2 patogener. Både cystor och trofozoiter kan vara infektiösa för människor. |
Avdöda odlingsplattor med provmaterial och referensstam med 70 % sprit och placera dem i riskavfallskartonger efter avslutad inkubation. | Avdöda odlingsplattor med provmaterial och referensstam med 70 % sprit och placera dem i riskavfallskartonger efter avslutad inkubation. | ||
| − | Referenser | + | ==Referenser== |
| − | + | *Visvesvara G S. Laboratory diagnosis. In: E. G. Rondanelli, editors. Amphizoic amoebae. Human pathology. Padova: Piccin Nuova Libraria 1987:194-215. | |
| − | + | *Auran JD, Starr MB, Jakobiec FA. Acanthamoeba Keratitis. A Review of the Literature. Cornea 1987;6 (1):2-26. | |
| − | + | *Ash L, Orihel T. Atlas of human Parasitology, ASCP Press, Chicago. | |
| + | |||
| + | [[Kategori:Parasiter]] | ||
| + | [[Kategori:Laboratoriediagnostik]] | ||
| + | [[Kategori:Laboratoriediagnostik-parasiter]] | ||
| + | ---------- | ||
Nuvarande version från 6 december 2012 kl. 13.51
Huvudartikel, publicerad mars 2012.
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik
Odling av Acanthamoeba på non-nutrient agar[redigera]
Analysprincip[redigera]
Anrikning av Acanthamoeba från patientprov genom odling på non-nutrient agarplatta täckt med E. coli K12 bakterier som föda. Enstaka cystor som kan finnas i materialet excysterar och trofozoiter förökar sig och utvecklas så småningom till karakteristiska cystor som identifieras mikroskopiskt.
Reagenser[redigera]
Page´s saltlösning, steril
Lösning 1
- Na2HPO4 2.84 g
- KH2PO4 2.72 g
- destillerat vatten 500 ml
- Autoklavera, 20 min, 121ºC
Lösning 2
- MgSO4 7H2O 8.0 g
- CaCl2 2 H2O 8.0 g
- NaCl 0. 240 g
- destillerat vatten 500 ml
- Autoklavera, 20 min, 121ºC. Låt kallna till rumstemperatur, blanda lösning 1 och 2.
- Förvaring: kylskåp
Blodagar plattor
- Förvaring: kylskåp
- Hållbarhet: ca 4 veckor
E. coli K12 kultur
- Förvaring: kylskåp
- Hållbarhet: ca 4 veckor
Non-nutrient agar i rör, steril
- agar utan tillsatser 15g
- destillerat vatten, eller PBS eller Page´s saltlösning 1 000 ml
- Autoklavera, 20 min, 121 ºC. Portionera i sterila rör (20 ml/ rör)
Positiv kontroll: Acanthamoeba spp. kultur.
- Förvaring: kylskåp
- Hållbarhet: flera månader, så länge agarn ej är intorkad.
Analysprocedur[redigera]
Arbetet utförs i säkerhetsbänk. Handskar används genomgående.
Förberedelser[redigera]
A. Subkultivering av E. coli (1-2 dagar innan analysdag, äldre bakterier fungerar också).
- Stryk ut E. coli K12 på en ny blodagar platta.
- Inkubera plattorna upp och ned, minst 1 dygn, i 30 °C.
B. Gjutning av agarplattor (kan göras samma dag eller i förväg)
- Beräkna en agarplatta per provmaterial, plus en platta till positiva kontrollen. Till varje platta åtgår ett rör med non-nutrient agar.
- Smält non-nutrient agar i kokande vattenbad.
- Häll den smälta agarn i en petriskål och låt den stelna.
- Förvara förgjutna plattor till analysdag i kylskåp.
- Plattor inpackade i parafilm kan förvaras i en månad.
Analysdag[redigera]
1. Rumstemperera agarplattorna
2. Häll ca 0,5 mL Page´s saltlösning på blodagarplattan och slamma upp lite kolibakterier med en 10 µL bakteriologisk ögla. Tillsätt 3-4 droppar bakterie-suspension mitt på varje nonnutrient agarplatta. Sprid ut bakterierna med en 10 µL bakteriologisk ögla. Obs! Bakterielagret får inte vara flytande (låt överflödig vätska absorberas in i plattan).
3. Märk plattorna med analysdatum och provnummer. Märk också en platta för positiv kontroll och sätt undan till punkt 8.
4. Lägg provmaterial på plattan:
- Linsvätska centrifugeras först 500 x g, 5 min. Supernatanten sugs av och sedimentet inokuleras på plattan.
- Rör med biopsimaterial i transportmedium centrifugeras 500 x g, 5 min och supernatanten sugs av. Vävnadsbiopsi samt sediment inokuleras i mitten av plattan. Försök att undvikaöverflödig vätska!
- Kontaktlinser placeras i mitten av plattan.
5. Inkubera plattorna upp och ned i 30 °C i fuktkammare (plastpåse med en liten bit fuktad pappershandduk).
6. Tvätta arbetsytan med 70 % sprit.
7. Byt handskar.
8. Skär en ca 1 cm2 stor agarbit från platta med uppodlad referensstam av Acanthamoeba. Notera stamidentitet i analysprotokollet. Placera agarbiten upp och ned i mitten av plattan märkt positiv kontroll.
9. Inkubera plattan upp och ned i 30 °C i separat fuktkammare.
10. Inkubera alla plattor i en vecka.
Avläsning och bedömning.[redigera]
Varje arbetsdag granskas hela plattan i inverterat mikroskop. Leta efter cystor och/eller trofozoiter. Börja varje avläsning med patientprov, tvätta därefter mikroskopbordet, byt handskar och kontrollera referenskulturen. Gör ett utstryk eller imprint av kulturen vid positivt fynd i patientprov. Låt preparaten lufttorka. För färgning med Giemsa se bilaga PAR 09 .
Kriterier för identifiering av Acanthamoeba spp.[redigera]
Trofozoiter kan variera mellan 20–40 µm i diameter och kan ha olika former. Direktmikroskopi: Levande trofozoiter har en vakuol som tömmer sig flera gånger per minut. Cystorna, 12–18 µm i diameter, är polygonala, har dubbla väggar och ser ut som kristaller. Giemsafärgning: Cytoplasman i färgade trofozoiter innehåller flera vakuoler och har en centralt placerad kärna med en stor endosom (ref. 3).
Svarsrutin[redigera]
Växt av trofozoiter och/eller cystor av Acanthamoeba spp. påvisade i odling.
Ingen växt av Acanthamoeba spp. i odling.
Kvalitetssäkring[redigera]
Intern: Referensstam odlas samtidigt med proverna. Extern: saknas
Prestanda[redigera]
Negativt fynd utesluter ej Acanthamoeba spp.- infektion. Sensitivitet: är i genomsnitt 76 % för odling av ögonskrap. Högre sensitivitet kan fås vid odling av djup biopsi från hornhinnan (ref. 2). Specificitet: vid mikroskopisk påvisning kan endast genus anges.
Säkerhetsaspekter och avfallshantering[redigera]
Acanthamoeba spp tillhör skyddsklass 2 patogener. Både cystor och trofozoiter kan vara infektiösa för människor. Avdöda odlingsplattor med provmaterial och referensstam med 70 % sprit och placera dem i riskavfallskartonger efter avslutad inkubation.
Referenser[redigera]
- Visvesvara G S. Laboratory diagnosis. In: E. G. Rondanelli, editors. Amphizoic amoebae. Human pathology. Padova: Piccin Nuova Libraria 1987:194-215.
- Auran JD, Starr MB, Jakobiec FA. Acanthamoeba Keratitis. A Review of the Literature. Cornea 1987;6 (1):2-26.
- Ash L, Orihel T. Atlas of human Parasitology, ASCP Press, Chicago.