Skillnad mellan versioner av "PAR 10 Odling av Acanthamoeba"

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
 
(27 mellanliggande sidversioner av samma användare visas inte)
Rad 1: Rad 1:
−
'''Huvudartikel, skapad i mars 2012. Texten är preliminär, ännu ej beslutad genom konsensusförfarande.'''   
+
'''Huvudartikel''', publicerad mars 2012.
  
 
-----
 
-----
−
''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik]] och till ''
+
''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik]] ''
 
----
 
----
  
Rad 9: Rad 9:
 
Anrikning av ''Acanthamoeba'' från patientprov genom odling på non-nutrient agarplatta täckt med ''E. coli'' K12 bakterier som föda. Enstaka cystor som kan finnas i materialet excysterar och trofozoiter förökar sig och utvecklas så småningom till karakteristiska cystor som identifieras mikroskopiskt.  
 
Anrikning av ''Acanthamoeba'' från patientprov genom odling på non-nutrient agarplatta täckt med ''E. coli'' K12 bakterier som föda. Enstaka cystor som kan finnas i materialet excysterar och trofozoiter förökar sig och utvecklas så småningom till karakteristiska cystor som identifieras mikroskopiskt.  
 
===Reagenser===  
 
===Reagenser===  
−
1. ''Page´s saltlösning'', steril
+
''' Page´s saltlösning''', steril
  
−
=====Lösning 1=====
+
''Lösning 1''
−
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>    2.84 g
 
  
−
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>   2.72 g
+
:Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 2.84 g
 +
:KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 2.72 g
 +
:destillerat vatten 500 ml
 +
:Autoklavera, 20 min, 121ºC
 +
''Lösning 2''
  
−
destillerat vatten   500 ml
+
:MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O 8.0 g
 +
:CaCl<sub>2</sub> 2 H<sub>2</sub>O 8.0 g
 +
:NaCl 0. 240 g
 +
:destillerat vatten 500 ml
 +
:Autoklavera, 20 min, 121ºC. Låt kallna till rumstemperatur, blanda lösning 1 och 2.
 +
:Förvaring: kylskåp
 +
'''Blodagar plattor'''
  
−
Autoklavera, 20 min, 121ºC
+
:Förvaring: kylskåp
 +
:Hållbarhet: ca 4 veckor
 +
''' ''E. coli'' K12 kultur'''
  
−
=====Lösning 2=====
+
:Förvaring: kylskåp
−
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O    8.0 g
+
:Hållbarhet: ca 4 veckor
 +
'''Non-nutrient agar i rör, steril'''
  
−
CaCl<sub>2</sub> 2 H<sub>2</sub>O    8.0 g
+
:agar utan tillsatser 15g
 +
:destillerat vatten, eller PBS eller Page´s saltlösning 1 000 ml
 +
:Autoklavera, 20 min, 121 ºC. Portionera i sterila rör (20 ml/ rör)
  
−
NaCl    0. 240 g
+
'''Positiv kontroll: ''Acanthamoeba'' spp. kultur'''.  
  
−
destillerat vatten  500 ml
+
:Förvaring: kylskåp
 +
:Hållbarhet: flera månader, så länge agarn ej är intorkad.
  
−
Autoklavera, 20 min, 121ºC. Låt kallna till rumstemperatur, blanda lösning 1 och 2.
 
−
 
−
Förvaring: kylskåp
 
−
 
−
2. ''Blodagar plattor''
 
−
 
−
Förvaring: kylskåp
 
−
 
−
Hållbarhet: ca 4 veckor
 
−
 
−
3. ''E. coli K12 kultur''
 
−
 
−
Förvaring: kylskåp
 
−
 
 
−
Hållbarhet: ca 4 veckor
 
−
 
−
4.'' Non-nutrient agar i rör, steril''
 
−
 
−
Agar utan tillsatser  15g
 
−
 
−
Destillerat vatten, eller PBS eller Page´s saltlösning 1 000 ml
 
−
 
−
Autoklavera, 20 min, 121 ºC. Portionera i sterila rör (20 ml/ rör)
 
−
 
 
−
5. ''Positiv kontroll: ''Acanthamoeba'' spp. kultur''.
 
−
 
−
Förvaring: kylskåp
 
−
Hållbarhet: flera månader, så länge agarn ej är intorkad.
 
 
===Analysprocedur===
 
===Analysprocedur===
 
Arbetet utförs i säkerhetsbänk. Handskar används genomgående.
 
Arbetet utförs i säkerhetsbänk. Handskar används genomgående.
 
====Förberedelser====  
 
====Förberedelser====  
−
A Subkultivering av ''E. coli'' (1-2 dagar innan analysdag, äldre bakterier fungerar också).
+
A. Subkultivering av ''E. coli'' (1-2 dagar innan analysdag, äldre bakterier fungerar också).
  
−
1. Stryk ut ''E. coli'' K12 på en ny blodagar platta.  
+
# Stryk ut ''E. coli'' K12 på en ny blodagar platta.  
−
 
+
# Inkubera plattorna upp och ned, minst 1 dygn, i 30 °C.  
−
2. Inkubera plattorna upp och ned, minst 1 dygn, i 30 °C.  
 
 
   
 
   
−
B Gjutning av agarplattor (kan göras samma dag eller i förväg)
+
B. Gjutning av agarplattor (kan göras samma dag eller i förväg)
−
 
 
−
1. Beräkna en agarplatta per provmaterial, plus en platta till positiva kontrollen. Till varje platta åtgår ett rör med non-nutrient agar.
 
−
 
 
−
2. Smält non-nutrient agar i kokande vattenbad.
 
−
 
 
−
3. Häll den smälta agarn i en petriskål och låt den stelna.
 
  
−
4. Förvara förgjutna plattor till analysdag i kylskåp.
+
# Beräkna en agarplatta per provmaterial, plus en platta till positiva kontrollen. Till varje platta åtgår ett rör med non-nutrient agar.
−
+
# Smält non-nutrient agar i kokande vattenbad.
−
5. Plattor inpackade i parafilm kan förvaras i en månad.
+
# Häll den smälta agarn i en petriskål och låt den stelna.
 +
# Förvara förgjutna plattor till analysdag i kylskåp.
 +
# Plattor inpackade i parafilm kan förvaras i en månad.
 
====Analysdag====
 
====Analysdag====
−
1. Rumstemperera agarplattorna.
+
1. Rumstemperera agarplattorna
  
 
2. Häll ca 0,5 mL Page´s saltlösning på blodagarplattan och slamma upp lite kolibakterier med en 10 µL bakteriologisk ögla. Tillsätt 3-4 droppar bakterie-suspension mitt på varje nonnutrient agarplatta. Sprid ut bakterierna med en 10 µL bakteriologisk ögla. Obs! Bakterielagret får inte vara flytande (låt överflödig vätska absorberas in i plattan).
 
2. Häll ca 0,5 mL Page´s saltlösning på blodagarplattan och slamma upp lite kolibakterier med en 10 µL bakteriologisk ögla. Tillsätt 3-4 droppar bakterie-suspension mitt på varje nonnutrient agarplatta. Sprid ut bakterierna med en 10 µL bakteriologisk ögla. Obs! Bakterielagret får inte vara flytande (låt överflödig vätska absorberas in i plattan).
Rad 84: Rad 66:
 
3. Märk plattorna med analysdatum och provnummer. Märk också en platta för positiv kontroll och sätt undan till punkt 8.
 
3. Märk plattorna med analysdatum och provnummer. Märk också en platta för positiv kontroll och sätt undan till punkt 8.
  
−
4. Lägg provmaterial på plattan:
+
4. Lägg provmaterial på plattan:  
−
*Linsvätska centrifugeras först 500 x g, 5 min. Supernatanten sugs av och sedimentet inokuleras på plattan.  
+
:* Linsvätska centrifugeras först 500 x g, 5 min. Supernatanten sugs av och sedimentet inokuleras på plattan.
−
*Rör med biopsimaterial i transportmedium centrifugeras 500 x g, 5 min och supernatanten sugs av. Vävnadsbiopsi samt sediment inokuleras i mitten av plattan. Försök att undvika överflödig vätska!  
+
−
*Kontaktlinser placeras i mitten av plattan.
+
:* Rör med biopsimaterial i transportmedium centrifugeras 500 x g, 5 min och supernatanten sugs av. Vävnadsbiopsi samt sediment inokuleras i mitten av plattan. Försök att undvikaöverflödig vätska!  
 +
:* Kontaktlinser placeras i mitten av plattan.
  
 
5. Inkubera plattorna upp och ned i 30 °C i fuktkammare (plastpåse med en liten bit fuktad pappershandduk).
 
5. Inkubera plattorna upp och ned i 30 °C i fuktkammare (plastpåse med en liten bit fuktad pappershandduk).
 +
 
6. Tvätta arbetsytan med 70 % sprit.
 
6. Tvätta arbetsytan med 70 % sprit.
 +
 
7. Byt handskar.
 
7. Byt handskar.
−
8. Skär en ca 1 cm2 stor agarbit från platta med uppodlad referensstam av Acanthamoeba. Notera stamidentitet i analysprotokollet. Placera agarbiten upp och ned i mitten av plattan märkt positiv kontroll.
+
 
 +
8. Skär en ca 1 cm<sup>2</sup> stor agarbit från platta med uppodlad referensstam av ''Acanthamoeba''. Notera stamidentitet i analysprotokollet. Placera agarbiten upp och ned i mitten av plattan märkt positiv kontroll.
 +
 
 
9. Inkubera plattan upp och ned i 30 °C i separat fuktkammare.
 
9. Inkubera plattan upp och ned i 30 °C i separat fuktkammare.
 +
 
10. Inkubera alla plattor i en vecka.
 
10. Inkubera alla plattor i en vecka.
−
Avläsning och bedömning.
+
 
 +
====Avläsning och bedömning.====
 
Varje arbetsdag granskas hela plattan i inverterat mikroskop. Leta efter cystor och/eller trofozoiter. Börja varje avläsning med patientprov, tvätta därefter mikroskopbordet, byt handskar och kontrollera referenskulturen.
 
Varje arbetsdag granskas hela plattan i inverterat mikroskop. Leta efter cystor och/eller trofozoiter. Börja varje avläsning med patientprov, tvätta därefter mikroskopbordet, byt handskar och kontrollera referenskulturen.
−
Gör ett utstryk eller imprint av kulturen vid positivt fynd i patientprov. Låt preparaten lufttorka. För färgning med Giemsa se bilaga PAR09.  
+
Gör ett utstryk eller imprint av kulturen vid positivt fynd i patientprov. Låt preparaten lufttorka. För färgning med Giemsa se bilaga [[PAR 09 Malariamikroskopi|PAR 09 ]].  
−
Kriterier för identifiering av Acanthamoeba spp.
+
=====Kriterier för identifiering av ''Acanthamoeba'' spp.=====
 
Trofozoiter kan variera mellan 20–40 µm i diameter och kan ha olika former.  
 
Trofozoiter kan variera mellan 20–40 µm i diameter och kan ha olika former.  
 
Direktmikroskopi: Levande trofozoiter har en vakuol som tömmer sig flera gånger per minut. Cystorna, 12–18 µm i diameter, är polygonala, har dubbla väggar och ser ut som kristaller.  
 
Direktmikroskopi: Levande trofozoiter har en vakuol som tömmer sig flera gånger per minut. Cystorna, 12–18 µm i diameter, är polygonala, har dubbla väggar och ser ut som kristaller.  
 
Giemsafärgning: Cytoplasman i färgade trofozoiter innehåller flera vakuoler och har en centralt placerad kärna med en stor endosom (ref. 3).
 
Giemsafärgning: Cytoplasman i färgade trofozoiter innehåller flera vakuoler och har en centralt placerad kärna med en stor endosom (ref. 3).
−
Svarsrutin
+
 
−
Växt av trofozoiter och/eller cystor av Acanthamoeba spp. påvisade i odling.
+
====Svarsrutin====
−
Ingen växt av Acanthamoeba spp. i odling.
+
Växt av trofozoiter och/eller cystor av ''Acanthamoeba'' spp. påvisade i odling.
−
Kvalitetssäkring
+
 
 +
Ingen växt av ''Acanthamoeba'' spp. i odling.
 +
====Kvalitetssäkring====
 
Intern: Referensstam odlas samtidigt med proverna.
 
Intern: Referensstam odlas samtidigt med proverna.
 
Extern: saknas
 
Extern: saknas
−
Prestanda
+
====Prestanda====
−
Negativt fynd utesluter ej Acanthamoeba spp.- infektion.
+
Negativt fynd utesluter ej ''Acanthamoeba'' spp.- infektion.
 
Sensitivitet: är i genomsnitt 76 % för odling av ögonskrap. Högre sensitivitet kan fås vid odling av djup biopsi från hornhinnan (ref. 2).   
 
Sensitivitet: är i genomsnitt 76 % för odling av ögonskrap. Högre sensitivitet kan fås vid odling av djup biopsi från hornhinnan (ref. 2).   
 
Specificitet: vid mikroskopisk påvisning kan endast genus anges.
 
Specificitet: vid mikroskopisk påvisning kan endast genus anges.
  
−
Säkerhetsaspekter och avfallshantering
+
====Säkerhetsaspekter och avfallshantering====
−
Acanthamoeba spp tillhör skyddsklass 2 patogener. Både cystor och trofozoiter kan vara infektiösa för människor.
+
''Acanthamoeba'' spp tillhör skyddsklass 2 patogener. Både cystor och trofozoiter kan vara infektiösa för människor.
 
Avdöda odlingsplattor med provmaterial och referensstam med 70 % sprit och placera dem i riskavfallskartonger efter avslutad inkubation.
 
Avdöda odlingsplattor med provmaterial och referensstam med 70 % sprit och placera dem i riskavfallskartonger efter avslutad inkubation.
  
−
Referenser
+
==Referenser==
−
1. Visvesvara G S. Laboratory diagnosis. In: E. G. Rondanelli, editors. Amphizoic amoebae. Human pathology. Padova: Piccin Nuova Libraria 1987:194-215.
+
*Visvesvara G S. Laboratory diagnosis. In: E. G. Rondanelli, editors. Amphizoic amoebae. Human pathology. Padova: Piccin Nuova Libraria 1987:194-215.
−
2. Auran JD, Starr MB, Jakobiec FA. Acanthamoeba Keratitis. A Review of the Literature. Cornea 1987;6 (1):2-26.
+
*Auran JD, Starr MB, Jakobiec FA. Acanthamoeba Keratitis. A Review of the Literature. Cornea 1987;6 (1):2-26.
−
3. Ash L, Orihel T. Atlas of human Parasitology.
+
*Ash L, Orihel T. Atlas of human Parasitology, ASCP Press, Chicago.
  
 
[[Kategori:Parasiter]]
 
[[Kategori:Parasiter]]
−
 
+
[[Kategori:Laboratoriediagnostik]]
 +
[[Kategori:Laboratoriediagnostik-parasiter]]
 
----------
 
----------

Nuvarande version från 6 december 2012 kl. 13.51

Huvudartikel, publicerad mars 2012.

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik

Odling av Acanthamoeba på non-nutrient agar[redigera]

Analysprincip[redigera]

Anrikning av Acanthamoeba från patientprov genom odling på non-nutrient agarplatta täckt med E. coli K12 bakterier som föda. Enstaka cystor som kan finnas i materialet excysterar och trofozoiter förökar sig och utvecklas så småningom till karakteristiska cystor som identifieras mikroskopiskt.

Reagenser[redigera]

Page´s saltlösning, steril

Lösning 1

Na2HPO4 2.84 g
KH2PO4 2.72 g
destillerat vatten 500 ml
Autoklavera, 20 min, 121ºC

Lösning 2

MgSO4 7H2O 8.0 g
CaCl2 2 H2O 8.0 g
NaCl 0. 240 g
destillerat vatten 500 ml
Autoklavera, 20 min, 121ºC. Låt kallna till rumstemperatur, blanda lösning 1 och 2.
Förvaring: kylskåp

Blodagar plattor

Förvaring: kylskåp
Hållbarhet: ca 4 veckor

E. coli K12 kultur

Förvaring: kylskåp
Hållbarhet: ca 4 veckor

Non-nutrient agar i rör, steril

agar utan tillsatser 15g
destillerat vatten, eller PBS eller Page´s saltlösning 1 000 ml
Autoklavera, 20 min, 121 ºC. Portionera i sterila rör (20 ml/ rör)

Positiv kontroll: Acanthamoeba spp. kultur.

Förvaring: kylskåp
Hållbarhet: flera månader, så länge agarn ej är intorkad.

Analysprocedur[redigera]

Arbetet utförs i säkerhetsbänk. Handskar används genomgående.

Förberedelser[redigera]

A. Subkultivering av E. coli (1-2 dagar innan analysdag, äldre bakterier fungerar också).

  1. Stryk ut E. coli K12 på en ny blodagar platta.
  2. Inkubera plattorna upp och ned, minst 1 dygn, i 30 °C.

B. Gjutning av agarplattor (kan göras samma dag eller i förväg)

  1. Beräkna en agarplatta per provmaterial, plus en platta till positiva kontrollen. Till varje platta åtgår ett rör med non-nutrient agar.
  2. Smält non-nutrient agar i kokande vattenbad.
  3. Häll den smälta agarn i en petriskål och låt den stelna.
  4. Förvara förgjutna plattor till analysdag i kylskåp.
  5. Plattor inpackade i parafilm kan förvaras i en månad.

Analysdag[redigera]

1. Rumstemperera agarplattorna

2. Häll ca 0,5 mL Page´s saltlösning på blodagarplattan och slamma upp lite kolibakterier med en 10 µL bakteriologisk ögla. Tillsätt 3-4 droppar bakterie-suspension mitt på varje nonnutrient agarplatta. Sprid ut bakterierna med en 10 µL bakteriologisk ögla. Obs! Bakterielagret får inte vara flytande (låt överflödig vätska absorberas in i plattan).

3. Märk plattorna med analysdatum och provnummer. Märk också en platta för positiv kontroll och sätt undan till punkt 8.

4. Lägg provmaterial på plattan:

  • Linsvätska centrifugeras först 500 x g, 5 min. Supernatanten sugs av och sedimentet inokuleras på plattan.
  • Rör med biopsimaterial i transportmedium centrifugeras 500 x g, 5 min och supernatanten sugs av. Vävnadsbiopsi samt sediment inokuleras i mitten av plattan. Försök att undvikaöverflödig vätska!
  • Kontaktlinser placeras i mitten av plattan.

5. Inkubera plattorna upp och ned i 30 °C i fuktkammare (plastpåse med en liten bit fuktad pappershandduk).

6. Tvätta arbetsytan med 70 % sprit.

7. Byt handskar.

8. Skär en ca 1 cm2 stor agarbit från platta med uppodlad referensstam av Acanthamoeba. Notera stamidentitet i analysprotokollet. Placera agarbiten upp och ned i mitten av plattan märkt positiv kontroll.

9. Inkubera plattan upp och ned i 30 °C i separat fuktkammare.

10. Inkubera alla plattor i en vecka.

Avläsning och bedömning.[redigera]

Varje arbetsdag granskas hela plattan i inverterat mikroskop. Leta efter cystor och/eller trofozoiter. Börja varje avläsning med patientprov, tvätta därefter mikroskopbordet, byt handskar och kontrollera referenskulturen. Gör ett utstryk eller imprint av kulturen vid positivt fynd i patientprov. Låt preparaten lufttorka. För färgning med Giemsa se bilaga PAR 09 .

Kriterier för identifiering av Acanthamoeba spp.[redigera]

Trofozoiter kan variera mellan 20–40 µm i diameter och kan ha olika former. Direktmikroskopi: Levande trofozoiter har en vakuol som tömmer sig flera gånger per minut. Cystorna, 12–18 µm i diameter, är polygonala, har dubbla väggar och ser ut som kristaller. Giemsafärgning: Cytoplasman i färgade trofozoiter innehåller flera vakuoler och har en centralt placerad kärna med en stor endosom (ref. 3).

Svarsrutin[redigera]

Växt av trofozoiter och/eller cystor av Acanthamoeba spp. påvisade i odling.

Ingen växt av Acanthamoeba spp. i odling.

Kvalitetssäkring[redigera]

Intern: Referensstam odlas samtidigt med proverna. Extern: saknas

Prestanda[redigera]

Negativt fynd utesluter ej Acanthamoeba spp.- infektion. Sensitivitet: är i genomsnitt 76 % för odling av ögonskrap. Högre sensitivitet kan fås vid odling av djup biopsi från hornhinnan (ref. 2). Specificitet: vid mikroskopisk påvisning kan endast genus anges.

Säkerhetsaspekter och avfallshantering[redigera]

Acanthamoeba spp tillhör skyddsklass 2 patogener. Både cystor och trofozoiter kan vara infektiösa för människor. Avdöda odlingsplattor med provmaterial och referensstam med 70 % sprit och placera dem i riskavfallskartonger efter avslutad inkubation.

Referenser[redigera]

  • Visvesvara G S. Laboratory diagnosis. In: E. G. Rondanelli, editors. Amphizoic amoebae. Human pathology. Padova: Piccin Nuova Libraria 1987:194-215.
  • Auran JD, Starr MB, Jakobiec FA. Acanthamoeba Keratitis. A Review of the Literature. Cornea 1987;6 (1):2-26.
  • Ash L, Orihel T. Atlas of human Parasitology, ASCP Press, Chicago.
Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=PAR_10_Odling_av_Acanthamoeba&oldid=12614"