Skillnad mellan versioner av "PAR 03 Mikroskopisk påvisning av trofozoiter efter trikromfärgning"

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
 
(30 mellanliggande sidversioner av samma användare visas inte)
Rad 1: Rad 1:
−
'''Huvudartikel, reviderad i mars 2012. Texten är preliminär, ännu ej beslutad genom konsensusförfarande.'''   
+
'''Huvudartikel''', reviderad i mars 2012.  
  
 
-----
 
-----
−
''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik]] och till [[Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002|Tarminfektioner]]''
+
''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik]] och [[Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002|Tarminfektioner]]''
 
----
 
----
  
Rad 11: Rad 11:
 
====Speciell utrustning====
 
====Speciell utrustning====
 
Ljusmikroskop med immersionsobjektiv 50x och 100x samt kalibrerat mätokular.
 
Ljusmikroskop med immersionsobjektiv 50x och 100x samt kalibrerat mätokular.
−
====Reagens====
+
===Reagens===
 
*SAF-fixativ  
 
*SAF-fixativ  
−
*Natriumacetat  15 g
+
:natriumacetat          15 g
−
*Isättika    20 mL
+
:isättika              20 mL
−
*Formaldehyd (ca 37 %) 40 mL
+
:formaldehyd (ca 37 %) 40 mL
−
*Dest H2O   925 mL
+
:dest. H<sub>2</sub>O   925 mL
−
*Tween 20   några droppar
+
:Tween 20               några droppar
 
*natriumklorid 0,9 %
 
*natriumklorid 0,9 %
 
*albuminlösning
 
*albuminlösning
−
'''''Alternativ I'''''
+
:'''''Alternativ 1''''': färdigberedd lösning: exempelvis Mayers glycerin/albumin från DiaSys Ltd England
 +
:'''''Alternativ 2''''': egen beredning
 +
:''Material''
 +
:# ett färskt hönsägg
 +
:# steril bägare 100 mL
 +
:# steril sax
 +
:# filtrerpapper (nyöppnad kartong)
 +
:# steril tratt
 +
:# sterilt lock till Petriskål
 +
:# glycerol
 +
:# natriumazid 10 % (giftig) NaN<sub><small>3</small></sub>
 +
:''Beredning''
 +
:# tvätta ägget med sprit
 +
:# knäck det försiktigt och överför vitan till en bägare
 +
:# klipp äggvitan med en steril sax i ca 30 minuter tills allt är flytande
 +
:# häll över till ett rent filtrerpapper och låt rinna ner i ett sterilt rör. Täck med ett lock från en Petriskål
 +
:# låt alltsammans stå i kylskåp över natt och filtrera klart
 +
:# uppskatta volymen
 +
:# tillsätt glycerol i förhållandet 50/50. Andelen glycerol kan ökas beroende på tjockleken på äggvitan.
 +
:# sätt till 2 µl natriumazid per mL färdig albuminlösning
 +
*etanol 70 %
 +
*trikromfärg
 +
:'''''Alternativ 1''''': Trichrome stain från Meridian Diagnostics (ref. 1)
 +
:'''''Alternativ 2''''': För egen beredning av reagens se referens 3 och 4.
 +
*ättiksyra i etanol 90 %, avfärgningslösning för trikromfärgning
 +
:ättikssyra (isättika) 100 % 4,5 mL
 +
:etanol 90 % 995,5 mL
 +
*etanol 95 %
 +
*etanol 99,5 %
 +
*xylol eller xylolsubstitut
 +
*kompatibelt monteringsmedium
 +
*immersionsolja för ljusmikroskopi
  
−
Färdigberedd lösning: Exempelvis Mayers glycerin/albumin från DiaSys Ltd England
+
===Analysprocedur===
 +
Observera att varje färgningsomgång skall innehålla en positiv kontroll. Se under kvalitetssäkring.
 +
# Nytagen feces (utan tillsats) fixeras omedelbart i SAF-fixativ (en del feces till tre delar SAF). Blanda feces och fixativ ordentligt med träpinnar. Låt stå minst 30 min. Prover som insänts i SAF-fixativ blandas på nytt; rör om med träpinnar.
 +
# Filtrera en del av blandningen genom ett lager fuktad gasväv lagt över en engångsmugg. OBS: Filtratet kan screenas i direktmikroskopi för trofozoitförekomst innan man går vidare med färgningen.
 +
# Häll över ca 3 mL av den filtrerade blandningen till ett centrifugrör. Fyll röret med 0,9 % NaCl.
 +
# Centrifugera 1 min i 800 x g.
 +
# Häll av ovanvätskan så att ca 1 mL finns kvar i röret. Späd med 0,9 % NaCl om provet verkar för tjockt.
 +
# Droppa en droppe albuminlösning och en droppe av provet på ett objektglas märkt med labnr. Blanda om med en träpinne och gör ett tunt utstryk som varierar i tjocklek.
 +
# Låt preparatet torka tills det ser "klibbigt" ut (ca 10–20 min).
 +
====Fixering och färgningsprocedur====
 +
Låt överskottsvätska rinna av mot en allduk mellan varje kyvett.
 +
# Fixera glaset 30 min i 70 % etanol.
 +
# Låt stå i trikromfärg 6–8 min. Torka försiktigt av överskottsfärg mot en allduk.
 +
# Doppa glaset i avfärgningslösning (ättiksyra i etanol). Observera glaset noggrant. Stoppa ner det i nästa bad precis när färgen börjar rinna från utstryket. Två snabba dopp brukar vara tillräckligt.
 +
# Skölj 2 gånger i 95 % etanol.
 +
# Låt stå i 95 % etanol 5 min (ny kyvett).
 +
# Låt stå i 99,5 % etanol 3 min.
 +
# Låt stå i xylol alternativt xylolsubstitut 3 min.
 +
# Montera glaset med kompatibel monteringsmedium och täckglas. Låt torka i dragskåp.
 +
====Avläsning av preparat====
 +
Granska 100 synfält med immersionsobjektiv 50x. För identifiering av trofozoiter och cystor används immersionsobjektiv 100x. Använd mätokular när så behövs. För morfolologiska kriterier av de olika parasiterna se under respektive avsnitt.
 +
====Kvalitetssäkring====
 +
'''Intern'''
  
−
'''''Alternativ II'''''
+
:Positiv kontroll: fecesprov innehållande tvättade SAF-fixerade ''Dientamoeba fragilis'' trofozoiter (eller annan lämplig parasit). Förvaras i kylskåp.
 +
:Intern panel bestående av färgade prov med olika trofozoiter.
 +
:Lämpligt bildmaterial finns under ref 2 och 3.
 +
'''Extern'''
  
−
Egen beredning
+
Giemsa-färgade trofozoiter ingår i UK-NEQAS feces-utskick.
  
−
''Material''
+
====Svarsrutin====
−
# Ett färskt hönsägg
+
Negativt prov: Inga trofozoiter påvisade
−
# Steril bägare 100 mL
 
−
# Steril sax
 
  
−
# Filtrerpapper (nyöppnad kartong)
+
Positivt prov: Trofozoiter av ''Dientamoeba fragilis'' påvisade
−
# Steril tratt
 
−
# Sterilt lock till Petriskål
 
−
# Glycerol
 
  
−
# Natriumazid 10 % (giftig) NaN3
+
====Anmärkningar====
 +
Metoden lämpar sig särskilt väl för diagnostik av ''Dientamoeba fragilis'' då denna parasit saknar cystform.
  
−
''Beredning''
+
==REFERENSER==
−
1. Tvätta ägget med sprit
+
1. Meridian produktinformation för Para-Pak SAF-rör och Para-Pak Trichrome stain.
−
2. Knäck det försiktigt och överför vitan till en bägare.
 
−
3. Klipp äggvitan med en steril sax i ca 30 minuter tills allt är flytande
 
−
4. Häll över till ett rent filtrerpapper och låt rinna ner i ett sterilt rör. Täck med ett lock från en Petriskål.
 
−
5. Låt alltsammans stå i kylskåp över natt och filtrera klart.
 
−
6. Uppskatta volymen.
 
−
7. Tillsätt glycerol i förhållandet 50/50. Andelen glycerol kan ökas beroende på tjockleken på äggvitan.
 
−
8. Sätt till 2 µl natriumazid per mL färdig albuminlösning
 
−
etanol 70 %
 
−
trikromfärg
 
−
Alternativ 1: Trichrome stain från Meridian Diagnostics (ref 1)
 
−
Alternativ 2: För egen beredning av reagens se referens 3 och 4.
 
−
ättiksyra i etanol 90 %
 
−
avfärgningslösning för trikromfärgning
 
−
Ättikssyra (isättika) 100 % 4,5 mL
 
−
Etanol 90 %  995,5 mL
 
−
etanol 95 %
 
−
etanol 99,5 %
 
−
xylol eller xylolsubstitut
 
−
kompatibelt monteringsmedium
 
−
immersionsolja för ljusmikroskopi
 
−
Analysprocedur
 
−
Observera att varje färgningsomgång skall innehålla en positiv kontroll. Se under kvalitetssäkring.
 
−
1. Nytagen feces (utan tillsats) fixeras omedelbart i SAF-fixativ (en del feces till tre delar SAF). Blanda feces och fixativ ordentligt med träpinnar. Låt stå minst 30 min. Prover som insänts i SAF-fixativ blandas på nytt; rör om med träpinnar.
 
−
2. Filtrera en del av blandningen genom ett lager fuktad gasväv lagt över en engångsmugg.
 
−
OBS: Filtratet kan screenas i direktmikroskopi för trofozoitförekomst innan man går vidare med färgningen.
 
−
3. Häll över ca 3 mL av den filtrerade blandningen till ett centrifugrör. Fyll röret med 0,9 % NaCl.
 
−
4. Centrifugera 1 min i 800 x g.
 
−
5. Häll av ovanvätskan så att ca 1 mL finns kvar i röret. Späd med 0,9 % NaCl om provet verkar för tjockt.
 
−
6. Droppa en droppe albuminlösning och en droppe av provet på ett objektglas märkt med labnr. Blanda om med en träpinne och gör ett tunt utstryk som varierar i tjocklek.
 
−
7. Låt preparatet torka tills det ser "klibbigt" ut (ca 10–20 min).
 
−
Fixering och färgningsprocedur
 
−
Låt överskottsvätska rinna av mot en allduk mellan varje kyvett.
 
−
1. Fixera glaset 30 min i 70 % etanol.
 
−
2. Låt stå i trikromfärg 6–8 min.
 
−
Torka försiktigt av överskottsfärg mot en allduk.
 
−
3. Doppa glaset i avfärgningslösning (ättiksyra i etanol). Observera glaset noggrant. Stoppa ner det i nästa bad precis när färgen börjar rinna från utstryket. Två snabba dopp brukar vara tillräckligt.
 
−
4. Skölj 2 gånger i 95 % etanol.
 
−
5. Låt stå i 95 % etanol 5 min (ny kyvett).
 
−
6. Låt stå i 99,5 % etanol 3 min.
 
−
7. Låt stå i xylol alternativt xylolsubstitut 3 min.
 
−
8. Montera glaset med kompatibel monteringsmedium och täckglas. Låt torka i dragskåp.
 
−
Avläsning av preparat
 
−
Granska 100 synfält med immersionsobjektiv 50x. För identifiering av trofozoiter och cystor används immersionsobjektiv 100x. Använd mätokular när så behövs. För morfolologiska kriterier av de olika parasiterna se under respektive avsnitt.
 
−
Kvalitetssäkring
 
−
Intern
 
−
Positiv kontroll: Fecesprov innehållande tvättade SAF-fixerade Dientamoeba fragilis trofozoiter (eller annan lämplig parasit). Förvaras i kylskåp.
 
−
Intern panel bestående av färgade prov med olika trofozoiter.
 
−
Lämpligt bildmaterial finns under ref 2 och 3.
 
−
Extern
 
−
Giemsa-färgade trofozoiter ingår i UK-NEQAS feces-utskick.
 
−
Svarsrutin
 
−
Negativt prov: Inga trofozoiter påvisade
 
−
Positivt prov. Trofozoiter av Dientamoeba fragilis påvisade
 
−
Anmärkningar
 
−
Metoden lämpar sig särskilt väl för diagnostik av Dientamoeba fragilis då denna parasit saknar cystform.
 
  
−
REFERENSER
 
−
1. Meridian produktinformation för Para-Pak SAF-rör och Para-Pak Trichrome stain.
 
 
2. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 5-9 Protozoa.
 
2. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 5-9 Protozoa.
 +
 
3. Ash L, Orihel T. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago.
 
3. Ash L, Orihel T. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago.
 +
 
4. Garcia L. Diagnostic Medical Parasitology. ASM Press, Washington.
 
4. Garcia L. Diagnostic Medical Parasitology. ASM Press, Washington.
 +
  
  
 
[[Kategori:Parasiter]]
 
[[Kategori:Parasiter]]
−
 
+
[[Kategori:Laboratoriediagnostik]]
 +
[[Kategori:Laboratoriediagnostik-parasiter]]
 
----------
 
----------

Nuvarande version från 6 december 2012 kl. 13.55

Huvudartikel, reviderad i mars 2012.

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik och Tarminfektioner

Mikroskopisk påvisning av trofozoiter efter trikromfärgning.[redigera]

Analysprincip/provmaterial[redigera]

Cytokemisk färgningsmetod speciellt lämpad för påvisning av trofozoiter. Även cystor kan påvisas med denna metod. Feces eller annat provmaterial fixeras i SAF (sodium acetate-acetic acid- formalin) fixativ i omedelbar anslutning till provtagningen. Parasiterna infärgas i olika röda och blågröna nyanser mot en grön bakgrund. Observation sker i ljusmikroskop. Screening för trofozoiter kan utföras på filtrerad SAF-fixerad feces innan man går vidare med verifierande färgning.

Speciell utrustning[redigera]

Ljusmikroskop med immersionsobjektiv 50x och 100x samt kalibrerat mätokular.

Reagens[redigera]

  • SAF-fixativ
natriumacetat 15 g
isättika 20 mL
formaldehyd (ca 37 %) 40 mL
dest. H2O 925 mL
Tween 20 några droppar
  • natriumklorid 0,9 %
  • albuminlösning
Alternativ 1: färdigberedd lösning: exempelvis Mayers glycerin/albumin från DiaSys Ltd England
Alternativ 2: egen beredning
Material
  1. ett färskt hönsägg
  2. steril bägare 100 mL
  3. steril sax
  4. filtrerpapper (nyöppnad kartong)
  5. steril tratt
  6. sterilt lock till Petriskål
  7. glycerol
  8. natriumazid 10 % (giftig) NaN3
Beredning
  1. tvätta ägget med sprit
  2. knäck det försiktigt och överför vitan till en bägare
  3. klipp äggvitan med en steril sax i ca 30 minuter tills allt är flytande
  4. häll över till ett rent filtrerpapper och låt rinna ner i ett sterilt rör. Täck med ett lock från en Petriskål
  5. låt alltsammans stå i kylskåp över natt och filtrera klart
  6. uppskatta volymen
  7. tillsätt glycerol i förhållandet 50/50. Andelen glycerol kan ökas beroende på tjockleken på äggvitan.
  8. sätt till 2 µl natriumazid per mL färdig albuminlösning
  • etanol 70 %
  • trikromfärg
Alternativ 1: Trichrome stain från Meridian Diagnostics (ref. 1)
Alternativ 2: För egen beredning av reagens se referens 3 och 4.
  • ättiksyra i etanol 90 %, avfärgningslösning för trikromfärgning
ättikssyra (isättika) 100 % 4,5 mL
etanol 90 % 995,5 mL
  • etanol 95 %
  • etanol 99,5 %
  • xylol eller xylolsubstitut
  • kompatibelt monteringsmedium
  • immersionsolja för ljusmikroskopi

Analysprocedur[redigera]

Observera att varje färgningsomgång skall innehålla en positiv kontroll. Se under kvalitetssäkring.

  1. Nytagen feces (utan tillsats) fixeras omedelbart i SAF-fixativ (en del feces till tre delar SAF). Blanda feces och fixativ ordentligt med träpinnar. Låt stå minst 30 min. Prover som insänts i SAF-fixativ blandas på nytt; rör om med träpinnar.
  2. Filtrera en del av blandningen genom ett lager fuktad gasväv lagt över en engångsmugg. OBS: Filtratet kan screenas i direktmikroskopi för trofozoitförekomst innan man går vidare med färgningen.
  3. Häll över ca 3 mL av den filtrerade blandningen till ett centrifugrör. Fyll röret med 0,9 % NaCl.
  4. Centrifugera 1 min i 800 x g.
  5. Häll av ovanvätskan så att ca 1 mL finns kvar i röret. Späd med 0,9 % NaCl om provet verkar för tjockt.
  6. Droppa en droppe albuminlösning och en droppe av provet på ett objektglas märkt med labnr. Blanda om med en träpinne och gör ett tunt utstryk som varierar i tjocklek.
  7. Låt preparatet torka tills det ser "klibbigt" ut (ca 10–20 min).

Fixering och färgningsprocedur[redigera]

Låt överskottsvätska rinna av mot en allduk mellan varje kyvett.

  1. Fixera glaset 30 min i 70 % etanol.
  2. Låt stå i trikromfärg 6–8 min. Torka försiktigt av överskottsfärg mot en allduk.
  3. Doppa glaset i avfärgningslösning (ättiksyra i etanol). Observera glaset noggrant. Stoppa ner det i nästa bad precis när färgen börjar rinna från utstryket. Två snabba dopp brukar vara tillräckligt.
  4. Skölj 2 gånger i 95 % etanol.
  5. Låt stå i 95 % etanol 5 min (ny kyvett).
  6. Låt stå i 99,5 % etanol 3 min.
  7. Låt stå i xylol alternativt xylolsubstitut 3 min.
  8. Montera glaset med kompatibel monteringsmedium och täckglas. Låt torka i dragskåp.

Avläsning av preparat[redigera]

Granska 100 synfält med immersionsobjektiv 50x. För identifiering av trofozoiter och cystor används immersionsobjektiv 100x. Använd mätokular när så behövs. För morfolologiska kriterier av de olika parasiterna se under respektive avsnitt.

Kvalitetssäkring[redigera]

Intern

Positiv kontroll: fecesprov innehållande tvättade SAF-fixerade Dientamoeba fragilis trofozoiter (eller annan lämplig parasit). Förvaras i kylskåp.
Intern panel bestående av färgade prov med olika trofozoiter.
Lämpligt bildmaterial finns under ref 2 och 3.

Extern

Giemsa-färgade trofozoiter ingår i UK-NEQAS feces-utskick.

Svarsrutin[redigera]

Negativt prov: Inga trofozoiter påvisade

Positivt prov: Trofozoiter av Dientamoeba fragilis påvisade

Anmärkningar[redigera]

Metoden lämpar sig särskilt väl för diagnostik av Dientamoeba fragilis då denna parasit saknar cystform.

REFERENSER[redigera]

1. Meridian produktinformation för Para-Pak SAF-rör och Para-Pak Trichrome stain.

2. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 5-9 Protozoa.

3. Ash L, Orihel T. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago.

4. Garcia L. Diagnostic Medical Parasitology. ASM Press, Washington.

Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=PAR_03_Mikroskopisk_påvisning_av_trofozoiter_efter_trikromfärgning&oldid=12621"