Odling och substrat-svamp

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Svampinfektioner

---

Odling och substrat

Liksom vid bakterieodling gäller att provet tas adekvat och transporteras snabbt till laboratoriet under förhindrande av uttorkning. Då antalet svampenheter, som växer ut som kolonier, brukar vara mindre än bakterieantalet vid motsvarande infektion är kvantiteten provmaterial viktig. Vid flytande prov bör cellerna koncentreras genom centrifugering. Angivna substrat finns beskrivna i bilaga 3 och kontrollstammar i bilaga 4.

Medier för primärisolering

De flesta svampar växer på tämligen okomplicerade medier liksom på vanliga substrat för primärisolering av bakterier. Ett välbeprövat svampsubstrat är Sabouraudagar (bilaga 3), som är ett enkelt glukos- och peptonsubstrat med pH 5,6. Ett måttligt surt pH gynnar de flesta svampar gentemot bakterier. Vissa svampar, t.ex. Candida glabrata, kräver ett lågt pH för att växa ut. För att hindra växt av bakterier brukar vanligtvis även antibiotika tillsättas. För att hindra växt av mögel vid primärodling av dermatofyter tillsätts cykloheximid (Actidion, toxiskt), vanligtvis i en koncentration på 0,5 g/L. Emellertid hämmas också många opportunistiska patogener som t.ex. vissa Candida-arter av cykloheximid varför ett medium fritt från sådant bör inkluderas. Dermatofyter och C. albicans hämmas dock ej.

BHI-agar (Brain Heart Infusion) är ett rikt medium, som framför allt kommer till användning vid odling av jästfasen av de geografiskt endemiska dimorfa patogenerna (bilaga 3).

CHROMagar används för primärisolering och presumtiv identifiering av olika jästsvamparter (bilaga 3). Olika jästpopulationer differentieras genom kolonimorfologi och färg. Härigenom underlättas också identifieringen av svamp i blandkulturer vilket har blivit särskilt intressant genom att C. krusei och C. glabrata har naturligt nedsatt känslighet mot flukonazol.

För primärkulturer och isolering kan agar gjutas i 9 cm petriskålar, gärna 40 mL per skål, för att hindra uttorkning. Om man har många petriskålar i termostatskåpet eller inkuberar vid lägre temperatur brukar inte uttorkningen vara något problem. Vid odling över 3 veckor rekommenderas snedagarrör med plasthatt som ej får sluta för tätt. Om man önskar bevara en kultur är det bättre att odla i ett skruvlocksförsett rör. Man bör dock komma ihåg att under svampens utväxt skruvlocket bör vara lättat för att tillåta tillgång på syrgas.

Medier

• Standardsubstrat för utvärtes prov (dermatofyter och andra utvärtes förekommande svampar):
  • -Sabouraudagar utan cykloheximid med antibiotika (bilaga 3)
  • -Dermatofyt test medium (DTM) med cycloheximid, antibiotika, indikator (bilaga 3)
  • -Mycobioticagar med cykloheximid + antibiotika (bilaga 3)
  • -se särskilt tillvägagångssätt för Malassezia,

• Standardsubstrat för invärtes prov (jästsvampar och andra invärtes förekommande svampar):
  • -Sabouraudagar med antibiotika (bilaga 3)
  • -Glukosblodagar med antibiotika (bilaga 3)
  • -CHROMagar (olika kommersiella alternativ finns)
  • -Brain Heart Infusion (BHI)-agar (bilaga 3) som tillägg vid odling av vävnadsbitar och vid djup och endemisk mykos

Inkubering

Temperatur: Svampodlingar från alla typer av prov inkuberas rutinmässigt vid 30 °C. Invärtesprov odlas därutöver vid 37 °C. Optimal temperatur för inkubering av dermatofytodlingar är 28-32 °C. Av mögel växer A. fumigatus och patogena zygomyceter vid såväl 30 °C som vid 37 °C och 42 °C.

Malassezia-arter växer bäst vid 30-35 °C. C. neoformans växer optimalt vid 30 °C men växer vanligen även vid 37 °C i motsats till övriga Cryptococcus spp. Dimorfa svampar växer i mögelfas vid 20-30 °C och i jästfas vid 37 °C. CHROMagar skall inkuberas i 37 °C.

Tid

Jästsvamp 1 vecka.

Misstänkt mögel 1-2 veckor.

För hår/hud är rutinmässig inkubationstid 3 veckor.

Malassezia-arter växer ofta fram efter 2-4 dagar men kulturerna bör inkuberas minst 7 dagar.

Likvor bör inkuberas 3-4 veckor även om majoriteten kryptokocker växer fram på några dagar.

Rekommendationen kan också utformas så att

• 1) invärtesodlingar läses efter 1-2 dagar och slutavläses efter ca 1 vecka, vid mögelmisstanke förlängt till 2 veckor och vid exotiska mykoser till 4 veckor,
• 2) utvärtesodlingar läses av efter 4-7 dagar och därefter en - två gånger i veckan. Slutavläsning efter ca 3 veckor.

Hud, hår och naglar

Material från dessa keratinhaltiga vävnader odlas enligt ovan. DTM-agar är ett selektiv- och indikatormedium för påvisande av dermatofyter (bilaga 3). Detta medium innehåller som pH-indikator fenolrött, vilket gör, att mediet blir rödfärgat omkring den begynnande dermatofytväxten på grund av snabb alkalisk reaktion, vilket är nästan specifikt för dermatofyter.

Omslag kan emellertid också ske vid växt av andra svampar t ex Chrysosporium-arter men framträder då ej förrän kolonin är utväxt och då oftast med svagare rödfärgning. Hudskrap fördelas jämnt över agarytan. Vanligen används en plast- eller platinanål som fuktats på agarmediet, vilket gör att hudflagorna fastnar på nålen och lätt kan överföras. Eftersom förekomsten av viabla dermatofytelement ofta är sparsam, är det viktigt att överföra så mycket som möjligt av provmaterialet.

Hår taget de första 6-7 mm från hårroten överförs till agarytan.

Nagelmaterial skrapas och sönderdelas i små fragment vid provtagningen, varvid man i synnerhet tar tillvara sköra och missfärgade delar.

Om prov tagits från epidermis med tejp överförs denna till agarytan (förslagsvis Sabouraud) och inkuberas tre dagar vid 30°C, varefter den avlägsnas.

De vanligaste patogena isolaten är för

• hud: Candida, Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum, Malassezia.

• hår: Trichophyton, Microsporum.

• nagel: Trichophyton, Candida (särskilt C. parapsilosis och C. albicans), Epidermophyton, Trichosporon, Scopulariopsis och Scytalidium (syn. Hendersonula).

• öga: Candida, Aspergillus, Fusarium, Acremonium.

• öra: Aspergillus, Candida, Scedosporium.

Odlingsteknik för Malassezia

Eftersom Malassezia-arter är lipofila behövs tillsats av lipider till odlingsmediet för växt. Därför rekommenderas odling på Dixon eller Leeming and Notman (LNA) agar. Odlingsplattan inkuberas vid 30 °C i plastpåse 7-10 dagar. Det är också en stor fördel att ha ökad luftfuktighet i inkubatorn. Vanligen växer kolonierna fram efter 2-4 dagar.

Odling från provtagningspinnar

Provtagning med pinne görs ofta från munhåla, näsa, nasofarynx, öga, vagina, uretra, sår, öra och hörselgång. Utodlingen är likartad som för bakterier.

Provpinnen stryks ut över agarytan och plattorna/rören inkuberas vid 30 och även vid 37 °C för snabbare utväxt.

De flesta jästsvampar växer ut inom 48 tim. Mögel och andra trådbildande svampar från t.ex. sår och yttre hörselgång kan kräva upp till en vecka. De vanligaste isolaten är Candida och Aspergillus.

Blododling

Blododling är en relativt okänslig metod för att påvisa invasiv svampinfektion, i synnerhet sådana orsakade av trådsvampar. Det låga utbytet vid blododlingar kan bero på att antalet svampar i blodet vanligen är ytterst lågt. En del av de förökningsbara svamparna, företrädesvis jästceller, förekommer intracellulärt. Val av blododlingsmetod spelar därför stor roll för utbytet. Frekvensen invasiva svampinfektioner har ökat under senare år.

Blododlingsrutinerna för svamp följer i stor utsträckning dem för bakterier. Viktigt är att man tar en stor blodvolym (30 mL), vilken fördelas på flera flaskor enligt tillverkarens anvisningar. Bactec rekommenderar särskild svampflaska medan BacTAlert och ESP använder samma som för bakterier. Internationellt rekommenderas fem dagars inkubationstid, vilken ev. kan förlängas vid svampmisstanke, eftersom det är känt att Histoplasma capsulatum växer långsamt, och vissa Cryptococcus neoformans-stammar kan ge svaga signaler.

Den gängse tolkningen är att det överlägsna resultatet med lys-centrifugeringsmetoden beror på att intrafagocytära svampceller frigörs. Hos patienter med brist på fagocyterande celler som vid leukemi i behandling torde denna mekanism ha mindre betydelse. Motsvarande höga utbyte har även uppnåtts med moderna, automatiserade odlingsmetoder. Detta anses bero på att inkuberingen i dessa fall sker med kraftig omskakning, vilket torde sönderdela fagocyterna, medan däremot de mer robusta jästcellerna icke påverkas negativt utan kan förökas. I praktiskt taget alla odlingssystem tar det längre tid för svamparna att växa ut än för bakterier. Tiden för de vanligaste Candida-arterna tycks dock ligga omkring ett dygn för de snabbaste systemen. Vid odling i buljong i icke automatiserade system bör blododlingsflaskan luftas med hjälp av en kanyl.

Det är en allmän erfarenhet, att invasiva svampinfektioner orsakade av Aspergillus ger inte positiva fynd vid blododlingar, sannolikt beroende på att mögeltrådarna vävs in i vävnadsstrukturen och få viabla svampelement lossnar och sprids med blodbanan. Situationen är dock annorlunda för Fusarium (ovanlig vid invasiv infektion), som ger positiva blododlingar och multipla septiska metastaser, bl.a. petekiala hudlesioner som tillväxer.