PAR 03 Mikroskopisk påvisning av trofozoiter efter trikromfärgning

Huvudartikel, reviderad i mars 2012. Texten är preliminär, ännu ej beslutad genom konsensusförfarande.

---

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik och till Tarminfektioner

---

Mikroskopisk påvisning av trofozoiter efter trikromfärgning.

Analysprincip/provmaterial

Cytokemisk färgningsmetod speciellt lämpad för påvisning av trofozoiter. Även cystor kan påvisas med denna metod. Feces eller annat provmaterial fixeras i SAF (sodium acetate-acetic acid- formalin) fixativ i omedelbar anslutning till provtagningen. Parasiterna infärgas i olika röda och blågröna nyanser mot en grön bakgrund. Observation sker i ljusmikroskop. Screening för trofozoiter kan utföras på filtrerad SAF-fixerad feces innan man går vidare med verifierande färgning.

Speciell utrustning

Ljusmikroskop med immersionsobjektiv 50x och 100x samt kalibrerat mätokular.

Reagens

• SAF-fixativ
• Natriumacetat 15 g
• Isättika 20 mL
• Formaldehyd (ca 37 %) 40 mL
• Dest. H₂O 925 mL
• Tween 20 några droppar
• natriumklorid 0,9 %
• albuminlösning

Alternativ I : färdigberedd lösning: exempelvis Mayers glycerin/albumin från DiaSys Ltd England

Alternativ II : egen beredning

Material

1. Ett färskt hönsägg
2. Steril bägare 100 mL
3. Steril sax
4. Filtrerpapper (nyöppnad kartong)
5. Steril tratt
6. Sterilt lock till Petriskål
7. Glycerol
8. Natriumazid 10 % (giftig) NaN3

Beredning

1. Tvätta ägget med sprit
2. Knäck det försiktigt och överför vitan till en bägare
3. Klipp äggvitan med en steril sax i ca 30 minuter tills allt är flytande
4. Häll över till ett rent filtrerpapper och låt rinna ner i ett sterilt rör. Täck med ett lock från en Petriskål
5. Låt alltsammans stå i kylskåp över natt och filtrera klart
6. Uppskatta volymen
7. Tillsätt glycerol i förhållandet 50/50. Andelen glycerol kan ökas beroende på tjockleken på äggvitan.
8. Sätt till 2 µl natriumazid per mL färdig albuminlösning

• etanol 70 %
• trikromfärg

Alternativ 1: Trichrome stain från Meridian Diagnostics (ref. 1)

Alternativ 2: För egen beredning av reagens se referens 3 och 4.

• ättiksyra i etanol 90 %
• avfärgningslösning för trikromfärgning

1. Ättikssyra (isättika) 100 % 4,5 mL
2. Etanol 90 % 995,5 mL

• etanol 95 %
• etanol 99,5 %
• xylol eller xylolsubstitut
• kompatibelt monteringsmedium
• immersionsolja för ljusmikroskopi

Analysprocedur

Observera att varje färgningsomgång skall innehålla en positiv kontroll. Se under kvalitetssäkring.

1. Nytagen feces (utan tillsats) fixeras omedelbart i SAF-fixativ (en del feces till tre delar SAF). Blanda feces och fixativ ordentligt med träpinnar. Låt stå minst 30 min. Prover som insänts i SAF-fixativ blandas på nytt; rör om med träpinnar.
2. Filtrera en del av blandningen genom ett lager fuktad gasväv lagt över en engångsmugg. OBS: Filtratet kan screenas i direktmikroskopi för trofozoitförekomst innan man går vidare med färgningen.
3. Häll över ca 3 mL av den filtrerade blandningen till ett centrifugrör. Fyll röret med 0,9 % NaCl.
4. Centrifugera 1 min i 800 x g.
5. Häll av ovanvätskan så att ca 1 mL finns kvar i röret. Späd med 0,9 % NaCl om provet verkar för tjockt.
6. Droppa en droppe albuminlösning och en droppe av provet på ett objektglas märkt med labnr. Blanda om med en träpinne och gör ett tunt utstryk som varierar i tjocklek.
7. Låt preparatet torka tills det ser "klibbigt" ut (ca 10–20 min).

Fixering och färgningsprocedur

Låt överskottsvätska rinna av mot en allduk mellan varje kyvett. 1. Fixera glaset 30 min i 70 % etanol. 2. Låt stå i trikromfärg 6–8 min. Torka försiktigt av överskottsfärg mot en allduk. 3. Doppa glaset i avfärgningslösning (ättiksyra i etanol). Observera glaset noggrant. Stoppa ner det i nästa bad precis när färgen börjar rinna från utstryket. Två snabba dopp brukar vara tillräckligt. 4. Skölj 2 gånger i 95 % etanol. 5. Låt stå i 95 % etanol 5 min (ny kyvett). 6. Låt stå i 99,5 % etanol 3 min. 7. Låt stå i xylol alternativt xylolsubstitut 3 min. 8. Montera glaset med kompatibel monteringsmedium och täckglas. Låt torka i dragskåp. Avläsning av preparat Granska 100 synfält med immersionsobjektiv 50x. För identifiering av trofozoiter och cystor används immersionsobjektiv 100x. Använd mätokular när så behövs. För morfolologiska kriterier av de olika parasiterna se under respektive avsnitt. Kvalitetssäkring Intern Positiv kontroll: Fecesprov innehållande tvättade SAF-fixerade Dientamoeba fragilis trofozoiter (eller annan lämplig parasit). Förvaras i kylskåp. Intern panel bestående av färgade prov med olika trofozoiter. Lämpligt bildmaterial finns under ref 2 och 3. Extern Giemsa-färgade trofozoiter ingår i UK-NEQAS feces-utskick. Svarsrutin Negativt prov: Inga trofozoiter påvisade Positivt prov. Trofozoiter av Dientamoeba fragilis påvisade Anmärkningar Metoden lämpar sig särskilt väl för diagnostik av Dientamoeba fragilis då denna parasit saknar cystform.

REFERENSER 1. Meridian produktinformation för Para-Pak SAF-rör och Para-Pak Trichrome stain. 2. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 5-9 Protozoa. 3. Ash L, Orihel T. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago. 4. Garcia L. Diagnostic Medical Parasitology. ASM Press, Washington.

---