Bilaga 6 (CNS)
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet
Bilaga 6
TBE: Bestämning av IgM-antikroppar med ELISA
Aktuell infektion hos icke-TBE-vaccinerad individ diagnostiseras serologiskt genom påvisning av IgM anti-TBE-aktivitet i serum med μ-capture ELISA. Antihumant IgM bundet till fast fas fångar IgM-antikroppsaktivitet i patientserum. TBE-specifik IgM-aktivitet indikeras med peroxidasmärkt renat TBE-virus antigen, följt av substratsteg.
Metod för detektion av IgM mot TBE-virus
μ-capture ELISA: Get-antihumant IgM (Cappel) spätt i coatingbuffert (0,05 mol/L karbonatbuffert pH 9,6) får binda till 96-hålsplattor av polystyren (Maxisorp, Nunc A, över natt i rumstemperatur. Därefter kan plattorna förvaras i +4 °C tills de används. Plattorna tvättas med tvättbuffert (0,9 % NaCl med 0,05 % tween) och eftercoatas med 5 % BSA i coatingbuffert i +37 °C 2 tim: Eftercoatade plattor kan förvaras i +4 °C i upp till 4 dagar.
Serumprov, samt positivt och negativt kontrollserum, spädes 1:200, 1:2000 och 1:20000 i ELISA-buffert (EB; PBS med 0,5% BSA och 0,05% tween). Den eftercoatade plattan tvättas med tvättbuffert och serumspädningarna sätts plattans brunnar, en brunn/spädning. Plattan inkuberas 1 tim +37 °C och tvättas. Peroxidasrnärkt TBE-antigen (Folkhälsomyndigheten) i uttitrerad spädning i EB sätts till alla brunnar med serumspädning, plattan inkuberas 2 tim +37 °C. Efter tvätt tillsätts substrat (1 mg/mL orthophenylendiamin i fosfat-citratbuffert pH 5,0 med 0,001 % H2O reaktionen stoppas efter 15 minuter med 2,5 mol/L H2S04 och absorbansen (OD) avläses vid 490 nm. Cut-off för positivt test är fastställt till OD 0,3.