Cellodling Chlamydia trachomatis-bilaga2
Huvudartikel: Klamydia
Sekundärlänk till Klamydia-laboratoriediagnostik
2 Primärisolering och identifiering av Chlamydia trachomatis med cellodling Modifierad från Ripa & Mårdh (1).
2.1. Substratrecept
2.1.1. Provtagningsmedium 2-SP buffert med fetalt kalvserum och antibiotika
68,46 g sucrose löst i aq. dest (liten mängd) 2,088 g K2HPO4 löst i aq. dest (60 mL) 1,088 g KH2PO4 löst i aq. dest (40 mL) Blandas och späds med aq. dest till slutvolym 1000 mL. pH 7,0 Autoklav 15 min. 120 C Ad. 10 % fetalt kalvserum (inaktiverat, 56 C, 30 min) varje batch testas för inhibitorisk effekt på C. trachomatis 10,0 mg/L gentamicin 2,5 mg/L amfotericin B 100 mg/L vankomycin
2.1.2. Cellodlingsmedium
RPMI 1640 Ad. 10 % fetalt kalvserum (inaktiverat) 1 % glutamin 10 mg/L gentamicin 2,5 mg/L amfotericin B
2.1.3. Provsättningsmedium Recept 2.1.2 + följande tillsatser
0,5 % (wt/vol) glukos 0,5-2,0 mg/L cykloheximid Koncentrationen testas för varje uppspädd lösning.
2.2. Cellslag Mykoplasmafria McCoy-celler med dokumenterad förmåga att vara värdcell för förökning av C. trachomatis används. Regelbunden kontroll för mykoplasma¬kontamination med PCR eller mykoplasmaodling rekommenderas.
2.3. Metod för primärisolering
För cellpropagering och spädning av prov används RPMI 1640 med tillsatser enligt recept 2.1.2. ovan.
Efter provsättning kompletteras detta medium med glukos och cykloheximid enligt recept 2.1.3. Observera att ny uttitrering av lämplig cykloheximidkoncentration (0,5-2,0 mg/L) bör göras vid varje ny beredning av cykloheximid. Likaså bör cykloheximidkoncentrationen uttitreras vid cellbyte. Denna uttitrering görs med kontroller enligt nedan och cykloheximidkoncentrationer 0,5-2,0 mg/L i 0,5 mg steg.
Cellodlingsförfarande enligt gängse normer. Cellerna kan propageras på 250 mL plastflaskor eller större plast- eller glasflaskor efter behov. Celler för provsättning passeras efter 2-4 dagar i täthet 1,5-2105 celler/mL (den erforderliga celltätheten beror på hur snabbt cellerna växer ut till ett konfluerande lager – för exakt inokulation räknas cellerna i Bürkerkammare). Till varje brunn i 24-håls cellodlingsplattor sätts 1 mL cellodlingsmedium med celler. Cellsuspensionen ska efter 1 dygns inkubering ge ett konfluerande cellager.
Provsättning Upptining av prov som varit frysta bör ske snabbt (37 °C vattenbad). Transportröret med isittande provtagningspinne skakas i Vortex, eventuellt med cirka 10 glaspärlor i röret. Grumliga prov (i allmänhet cervix) spädes med cellodlingsmedium 1:1, och ceentrifugeras 2-300g, 5 min. Från varje prov sätts till 2 brunnar: 0,5 mL ospätt prov + 0,5 ml cellodlingsmedium eller 1 mL spätt prov. Resten av provet fryses åter vid -20-70 °C. Vid varje analystillfälle sätts även positiv och negativ kontroll. Plattorna centrifugeras vid 3000g, 37 °C i 1 timme. Plattorna inkuberas sedan vid 37 °C i 2 timmar, CO2-termostat. Därefter byts till provsättningsmedium (2.1.3.) och plattorna inkuberas vid 37 °C i 2 dygn i CO2-termostat.
Färgning Medium avsugs från varje brunn. Cellerna fixeras i 1 mL 95 % etanol i 10 min. Etanolen hälls av. Cellerna färgas med fluoresceinmärkta monoklonala antikroppar mot C. trachomatis enligt fabrikantens instruktion. Avläsning sker i UV-mikroskop med filterkombination för fluoresceinisotiocyanat. För översiktsavläsning används 10 objektiv och för verifiering av misstänkt inklusion 40. En typiskt fluorescerande inklusion per brunn är tillräckligt för att ange provet som positivt. Den tidigare använda jodfärgningen ger lägre diagnostisk känslighet genom att färre typiska inklusioner ses i cellmattan (2)
Kontroller Den positiva kontrollen titreras i provtagningsmedium så att ett visst antal inklusioner, exempelvis 5 per 10 synfält, ses vid upprepade provsättningar. Om större avvikelser uppträder mellan olika analystillfällen, inklusive om inga inklusioner ses, byts positiv kontroll och/eller McCoy celler och orsak till avvikelsen klarläggs. Byte av McCoy celler, oavsett utfall av ovanstående kontroller, rekommenderas efter 6-8 veckor.
”Blind passage”
Prov som är negativa vid ovanstående färgning: Plattorna inkuberas ytterligare 1 dygn, dvs sammanlagt 3 dygn. Medium hälls av och 0,5 mL provtagningsmedium sätts till den inokulerade icke färgade brunnen för varje negativt prov. Cellerna skrapas loss med en pasteurpipett och förs över till en ny brunn med McCoy-celler. 0,5 mL cellodlingsmedium tillsätts. Därefter inkuberas och färgas cellerna som ovan. Genom denna ”blinda passage” kan sensitiviteten av odlingen ökas.
Referenser 1. Ripa, KT och Mårdh, P-A. Cultivation of Chlamydia trachomatis in cycloheximid-reated McCoy cells. J Clin MIcrobiol 1977, 6:323-331. 2. Stamm, WE et al. Detection of Chlamydia trachomatis inclusions in McCoy cell cultures with fluroescein-conjugated monoclonal antibodies. J Clin Microbiol 1983, 17:666-668.