Schistosoma spp.
Huvudartikel, publicerad augusti 2011. Texten är preliminär, ännu ej beslutad genom konsensusförfarande.
Till innehållsförteckning för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik
Schistosoma spp.
Smittämne
Human schistosomiasis orsakas av parasitära blodmaskar (trematoder). Parasiten har en infektiös larvform som finns i sötvatten i endemiska områden (t.ex. Malawisjön, Viktoriasjön). De vanligaste arterna är Schistosoma mansoni, S. japonicum och S. hematobium. I mindre utsträckning förekommer arterna S. intercalatum och S. mekongi.
Livscykel
Parasiten har en invecklad livscykel med människa som värd för hon- och hanmaskar och en sötvattensnäcka som intermediär värd, i vilken det infektiösa larvstadiet utvecklas. Den i vatten fritt levande larvformen av parasiten, cerkarien, attraheras till hud, tränger igenom den och vandrar med cirkulationen till leverns blodkärl. Efter cirka en månad har larverna utvecklas till könsmogna maskar, som producerar hundratals ägg per dygn. Äggen utsöndras via urinen eller avföringen, beroende på art. Om äggen kommer i kontakt med vatten kläcks de och en annan larvform, miracidier, frigörs. Dessa söker upp speciella snäckarter, borrar sig in genom snäckans mjukdelar och utvecklas så småningom till cerkarier. En enda snäcka kan utsöndra tusentals cerkarier.
Symtom och klinisk bild
Initialt kan överkänslighetsreaktioner uppträda, s.k. badklåda, dygnet efter parasitens penetration av huden (liknande symtom på människa ger fågelparasiter). Beroende på art kan symtomen variera. Diffusa symtom under parasitens migrations- och tillväxtfas kan vara: nässelutslag, feber, magvärk, förstorad lever och mjälte (Katayamafeber). Ofta ses eosinofili. Sjukdomssymtomen orsakas framför allt av de ägg som inte utsöndras utan som blir kvar i kroppen. Ägg i vävnader orsakar inflammation och granulombildning som leder till fibros och förkalkning. Vid S. hematobium-infektion skadas urinblåsan med hematuri som följd. Kronisk infektion kan leda till urinblåscancer. Vid infektion med S. mansoni och S. japonicum skadas främst levern och tarmen. I endemiska områden är infertilitet hos kvinnor ofta resultat av granulombildning runt ägg, som hamnat i äggledarna. Man ser också skador i hjärnan och centrala nervsystemet orsakade av ägg, som förirrat sig till dessa vävnader.
Epidemiologi
Sjukdomen förekommer i länder med tropiskt eller subtropiskt klimat. Åttiofem procent av de mer än 200 miljoner människor som är infekterade lever i Afrika, söder om Sahara. S. hematobium är den vanligaste arten och är endemisk i Afrika och Mellanöstern. S. mansoni förekommer i Afrika, Sydamerika (Brasilien, Surinam och Venezuela), Karibien (Puerto Rico, Santa Lucia, Guadeloupe, Martinique, Dominikanska republiken, Antigua och Monserrat) samt i vissa områden i Mellanöstern. S. japonicum finns i Kina (Changjiang-floden, Sichuan och Yunnan) och på Filippinerna.
Provtagning och transport
Urin
Provtagningsanvisningar
(se även bilaga)
Urin samlas mellan klockan 10:00 och 14:00. Alternativt samlas urin under 24 timmar. Små urinvolymer på ca 10 mL accepteras, men sensitiviteten blir låg.
Transport
Okonserverad urin bör undersökas så fort som möjligt. Undvik att sända prov i slutet av veckan eller inför en helg. Vid förväntad lång provtransport kan urinen konserveras genom tillsats av 1-2 mL 3,7 % formaldehyd (=10 % formalin) per 100 mL urin.
Feces
Provtagningsanvisningar
Cirka 1 gram feces läggs i burk eller rör med cirka 7 mL formaldehyd eller SAF (sodium acetate/ acetic acid/ formalin)-fixativ. Blanda. Även prov utan tillsats accepteras.
Transport
Inga speciella krav.
Blod/serum
Provtagningsanvisningar
Blodprov tas i rör utan tillsats.
Transport
Inga speciella krav.
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Eosinofili och förhöjt IgE är kännetecknande för maskinfektioner och indikerar ytterligare laboratorieundersökningar. Metoder som kan påvisa utsöndrade ägg i feces och/eller urin betraktas som referensmetoder. Vid låggradiga infektioner kan dock äggutsöndringen vara låg och intermittent och därför används även indirekta metoder (t.ex. indirekt immunfluorescens-test och ELISA) som mäter antikroppshalter i serumprover. Det finns metoder som mäter cirkulerade antigener i serum, urin, saliv och mjölk, men dessa är inte tillräckligt känsliga för att upptäcka låggradig infektion. Nyligen har en känslig PCR-ELISA testats för detektion av Schistosoma-DNA i feces (1).
Referensmetod urin
Mikroskopisk påvisning av maskägg, främst S. hematobium, efter filtrering och/eller sedimentering eller centrifugering av urin (2-4). S. mansoni kan utsöndras i urin.
Analysprocedur
Arbeta i dragskåp. Använd handskar.
A) Filtrering (används vid mindre volymer - ”4 timmars urin” - och klar urin)
1. Blötlägg ett membranfilter, med porstorlek 12 mikrometer, i en bägare med 0,9 % NaCl tillsammans med filterringen till en filterhållare.
2. Montera filterhållare och filter: det våta filtret läggs på underdelen av filterhållaren, ringen läggs ovanpå och sist skruvas överdelen på. Kontrollera noga att filtret sitter rakt.
3. Mät urinmängden i ett mätglas. Häll över urinen i en glasbägare.
4. Dra upp urin i en 10 - 50 mL plastspruta och anslut sprutan till filterhållaren.
5. Pressa urinen långsamt genom filtret, som hålls över en slaskflaska.
6. Demontera och fyll sprutan på nytt och fortsätt tills all urin är filtrerad.
7. Demontera och fyll sprutan med 10 mL 0,9 % NaCl och pressa igenom filtret.
8. Demontera, fyll sprutan med ca 10 mL luft och pressa igenom filtret.
9. Skruva isär filterhållaren. Flytta filtret med en pincett och lägg det upp och ned på ett objektglas. Tillsätt en droppe 0,9 % NaCl.
10. Täck med täckglas.
B) Sedimentering kombinerat med filtrering eller centrifugering (används vid stora urinvolymer, som t.ex. hel dygnsmängd).
1. Mät urinvolymen.
2. Häll över urinen i ett koniskt mätglas.
3. Låt sedimentera 30 - 60 min.
4. Sug försiktigt av supernatanten med vattensug utan att grumla upp bottensatsen. Lämna ca 100 mL i botten.
5. Filtrera bottensatsen enligt ovan (A) eller centrifugera enligt C vid mycket grumlig bottensats.
C) Centrifugering (görs när urinen är mycket grumlig, t.ex. p.g.a. epitelceller eller blod, samt vid mycket små urinvolymer)
1. Mät urinvolymen.
2. Fördela den i 10 eller 50 mL rör beroende på volymen.
3. Centrifugera i 500 x g under 2 min.
4. Häll av supernatanten.
5. Droppa sedimentet på objektsglas och lägg på ett täckglas.
Avläsningskriterier
Avläsning efter filtrering (A) eller sedimentering kombinerat med filtrering (B)
1. Undersök hela filtret i ljusmikroskop med 10x objektiv.
2. Bestäm Schistosoma-art. S. mansoni-ägg: ovalt, 114-175 x 45-70 mikrometer med en sidoställd tagg; S. hematobium-ägg: ovalt, 112-170 x 50-70 mikrometer med en terminal tagg. Alla arter har ett genomskinligt äggskal och innehåller ett miracidium. Tomma ägg och fria miracidier kan förekomma.
3. Räkna antalet ägg. Notera i objektiv 40x om äggen innehåller (levande) miracidier. OBS! detta går inte att bedöma om urinen blandats med konserveringsmedel.
Avläsning efter centrifugering (C) eller sedimentering kombinerat med centrifugering (B)
1. Lägg upp en droppe av sedimentet på objektglas och täck med täckglas.
2. Granska i ljusmikroskop med 10x objektiv.
3. Gör flera upplägg tills hela sedimentet är undersökt.
4. Bestäm Schistosoma-species (se ovan).
5. Räkna antalet ägg. Notera i objektiv 40x om äggen innehåller (levande) miracidier. OBS! detta går inte att bedöma om urinen blandats med konserveringsmedel.
Kvalitetssäkring urin
- Internkontroll
Filtrationsmetoden kan kontrolleras genom att urin med känt antal ägg filtreras och undersöks. Minst 75 % av äggen måste påvisas. Internkontroll utförs företrädesvis årligen (brist på positivt urinprov kan förlänga intervallen).
- Externkontroll
UK-NEQAS:s kvalitetskontroll
Svarsrutiner urin
Negativt prov: ”Inga ägg av Schistosoma spp. påvisade.” X mL urin undersökt.
Positivt prov: ”Ägg av Schistosoma (ange species) påvisade. Antal ägg/X mL urin. Levande/ej levande ägg”
Referensmetod feces
Mikroskopisk påvisning av maskägg efter formalin/etylacetat-koncentration av feces (5-6) för S. mansoni, S. japonicum-, S. intercalatum- och S. mekongi-ägg. Se bilaga PARx.
Kato-Katz är den klassiska referensmetoden för påvisning av S. mansoni- och S. japonicum-ägg i feces (7). Metoden har låg känslighet (detektiongräns 20 ägg per gram feces) och är användbar i endemiska områden. (Även maskägg från Ascaris, hakmask, Trichuris, Taenia, Oxyurus och Strongyloides kan detekteras med denna metod.)
Princip (Kato-Katz-metod)
En bestämd mängd feces pressas jämnt ut mellan ett objektsglas och en bit cellofan, som är indränkt i blandning av glycerol och malakitgrönt. Glycerol/malakitgrönt-lösningen gör provet transparent. Äggen räknas i mikroskop. Antal ägg på objektsglaset omvandlas till antal ägg per gram feces.
Avläsningskriterier
Bestäm Schistosoma-art. S. mansoni-ägg: ovalt, 114-175 x 45-70 mikrometer med sidoställd tagg; S. hematobium-ägg: ovalt, 112-170 x 50-70 mikrometer med en terminal tagg; S. japonicum-ägg: runt, 70-100 x 55-65 mikrometer med en liten sidoställd knopp; S. intercalatum: avlångt, 140-240 x 50-70 mikrometer med en terminal tagg. Alla arter har ett genomskinligt äggskal och innehåller ett miracidium. Tomma ägg och fria miracidier kan förekomma.
Kvalitetssäkring feces
- Internkontroll
Koncentrationsförfarandet kontrolleras en gång per år genom att prov med känt innehåll av maskägg bedöms före och efter koncentrering.
- Externkontroll
UK-NEQAS kvalitetskontroll
Svarsrutiner feces
Negativt prov utsvaras: ”Cystor/maskägg koncentrationsprov: Inga Schistosomaspp.-ägg påvisade.”
Positivt prov utsvaras: ”Cystor/maskägg koncentrationsprov: Ägg av Schistosoma (ange species) påvisade.”
Övriga metoder
Äggpåvisning i biopsiprover från tarmen efter prokto- eller rektoskopi.
Provet kan direkt undersökas i mikroskop efter förekomst av levande eller döda ägg.
Antikroppspåvisning
- Indirekt immunfluorescensmetod (8)
Princip Fluorescerande antikroppar mot humant immunglobulin används för att påvisa specifika antikroppar som reagerat med fryssnitt av S. mansoni-maskar.
Kvalitetssäkring
- Internkontroll
Positiva kontrollsera (1) serum från schistosomiasis-patient med antikroppar som reagerar med tarmepitelet i S. mansoni-masken, (2) serum från schistosomiasis-patient med antikroppar som reagerar med interstitiell vävnad i S. mansoni-masken. Negativa kontrollsera (1) serum från person som saknar antikroppar mot S. mansoni-masken, (2) serum från person med muskelantikroppar.
- Externkontroll
INSTAND och UK NEQAS kvalitetskontroll
- ELISA
Princip Enzymmärkta antikroppar mot humant immunglobulin används för att påvisa specifika antikroppar som reagerat med lösligt extrakt av S. mansoni-ägg-antigen, som bundits till en plastyta. Enzymaktiviteten mäts genom tillsats av substrat och kromogen. Avläsning sker i fotometer.
Kvalitetssäkring
- Internkontroll
(1) Korrektor: serum från person med antikroppar som reagerar med ägg-antigen från S. mansoni och ger det arbitära värdet 100. (2) Högpositiv acceptor: serum från person med antikroppar som reagerar med ägg-antigen från S. mansoni. Högpositiv acceptor visar om testomgången är tillräckligt känslig inom den högpositiva delen av mätintervallet. (3) Lågpositiv acceptor: serum från person med antikroppar som reagerar med ägg-antigen från S. mansoni. Lågpositiv acceptor visar om testomgången är tillräckligt känslig inom den lågpositiva delen av mätintervallet. (4) Negativ acceptor: serum från person som saknar antikroppar mot ägg-antigen från S. mansoni.
- Externkontroll
INSTAND och UK NEQAS kvalitetskontroll
Svarsrutiner blod/serum
Negativt prov utsvaras: ”Inga antikroppar mot Schistosoma påvisade <10 (indirekt immunfluorescens-metod); < x enheter (ELISA)” Positivt prov utsvaras: Antikoppar mot Schistosoma påvisade i titer x (indirekt immunfluorescens-metod); x enheter (ELISA)”
- Western blot
Princip Enzymmärkta antikroppar mot humant immunglobulin används för att påvisa specifika antikroppar som reagerat med antigen som separerats elektroforetiskt och bundits ett nitrocellulosa-membran. Enzymaktiviteten mäts genom tillsats av substrat och kromogen. Avläsning kan ske visuellt.
- Antigen/DNA-påvisning (se under ”Allmänt)
Laboratorierapportering
Schistosomiasis är inte anmälningspliktig. Bilagor Koncentration av cystor och maskägg Provtagningsanvisningar
Litteraturhänvisningar
1. Gomes LI, Dos Santos Marques LH, Enk MJ, de Oliveira MC, Coelho PM, Rabello A. 2010. Development and evaluation of a sensitive PCR-ELISA system for detection of schistosoma infection in feces. PLoS Negl Trop Dis 4: e664 2. Braun-Munzinger RA. 1986. Quantitative egg counts in schistosomiasis surveys. Parasitology Today 2: 82-3 3. Dazo B, Bilas J. 1974. Two new field techniques for detection and counting of Schistosoma haematobium eggs in urine samples with an evaluation of both methods Bulletin of the World Health Organization 51: 399-408 4. Peters P, Mahmoud A, Warren K, Ouma J, Siongok T. 1976. Field studies of a rapid, accurate means of quantifying Schistosoma haematobium eggs in urine samples. Bulletin of the World Health Organization 54: 159-62 5. Ridley DS, Hawgood BC. 1956. The value of formol-ether concentration of faecal cysts and ova. Journal of Clinical Pathology 9: 74-6 6. Young KH, Bullock SL, Melvin DM, Spruill CL. 1979. Ethyl acetate as a substitute for diethyl ether in the formalin-ether sedimentation technique. Journal of Clinical Microbiology 10: 852-3 7. Katz N, Chaves A, Pellegrino J. 1972. A simple device for quantitative stool thick-smear technique in Schistosomiasis mansoni. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 14: 397-400 8. Nash TE. 1978. Antbody respons to a polysaccaride antigen present in the schistosome gut. I. Sensitivity and specificity. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene 27: 939-43