Bilaga 4 (CNS)

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet

---

Bilaga 4

Enterovirus: Detektion av RNA med PCR-teknik enligt metod från Virusavdelningen, Huddinge sjukhus

Provtagningsmaterial: Cerebrospinalvätska

Reagens

A. RNA-extraktion

• Lysbuffert:
  • Guanidintiocyanat (Sigma), 4 mol/L
  • 25 mmol/L Natriumcitrat, pH 7,0
  • 0,5 % Natriumlaurylsarcosin

Denna stamlösning är hållbar i 3 månader.

Till 100 mL stamlösning sätts 15,4 mg DTT’ (ditiotreitol) till en slutkoncentration av 1,0 mniol/L före användandet.

• Glykogen typ IX (Sigma) 1 mg/mL
• Isopropanol -20 °C
• Etanol 70 %
• RNAsin 40 units/μL (Scandinavian Diagnostic Services) (SDS)

B. RT-PCR

• PCR-buffert (Perkin-Elmer 10 x PCR-buffert II):
  • 100 mmol/L Tris-HC1, pH 8,3, 500 mol/L KC1
  • MgCl₂ (Perkin-Elmer): 25 mmol/L
  • Taq-polymeras = värmestabilt DNA-polymeras (AmpliTaq i PerkinElmer: 5 units/μL
  • Revers Transkriptas M-JuLV 20 units/μL (Boehringer-Mannheim)
• dNTP, pH cirka 7,0. dNTP = ekvimolar blandning av 2’-deoxyadenosin-S- triofosfat (Pharmacia; pulver; Na-salt). 1,25 mmol/L av varje nukleotid.

• Startsekvenser (oligonukleotider; “primers”) i Enterovirus 5 icke translaterad region (UTR):
  • yttre: 1 5’-TCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3
    • 2 5-GAAACACGGACACCCAAAGTA-3
  • inre: 3 5-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’

storlek på PCR-fragment: 120 baspar

Elektroforesbuffert (10xTBE): Tris-HC1, 0,89 mol/L; Borsyra, 0,89 mol/L, EDTA (etylendiamintetraacetat-Na salt), 0,02 mol/L, pH 8,4. Späds 20x i Reversed Osmosis(RO)-vatten vid användning.

Agarosgelen, 3 % koncentration, gjuts i TBE-buffert.

Laddningsbuffert: Bromfenolblått (Chroma Geselischaft), 0,25 % (w/v); sukros 40 % (w/v)

Etidiumbromid (sigma), 10 mg/mL. Reagenset är mutagent, och skall alltid hanteras med handskar. Detta gäller även etidiumbromidfärgade geler

Förbrukningsartiklar

0,5 mL PCR-rör med snäppkork (Perkin-Elmer eller Treff)

NuSieve GTG (FMC-In Vitro) agaros

Pipettspetsar

Analysprocedur

De olika momenten i proceduren utförs i tre separata lokaler för att minimera riskerna för kontamination av prov-DNA med amplifierad produkt.

Provberedning ("Preplab")

• 200 μL lysbuffert pipetteras i Sarstedtrör.
• Tillsätt 20 μL glykogen.
• Tillsätt 50 μL likvor i prov och kontroller.
• Inkubera 10 min i rumstemperatur. 250 μL iskall isopropanol tillsätts och blandas på Vortex.
• Inkubera 5 min i rumstemperatur.
• Centrifugera i kylcentrifug (+4 °C) 14.000 x g 10 min; supernatanten sugs av och kastas.
• Tillsätt 0,5 mL 70 % etanol.
• Centrifugera i kylcentrifug (+4 °C) 14.000 x g 10 min; supernatanten sugs av och kastas.
• Torka bottensatsen i vacuumtork ca 30 min.
• Lös bottensatsen i 25 μL RO-vatten med RNAsin sp 1+24.
• Förvara lösningen vid -70 °C.

Uppsättning av reaktionsblandningen ("Rena rummet"; "pre-PCR2)

Reaktionsblandningen för kombinerad revers transkriptasreaktion och PCR (RT-PCR) blandas enligt följande (per rör):

10xPCR-buffert, 4 μL

dNTP-blandning (1,25 mmol/L av varje), 4 μL

MgC1₂ (25 mmol/L Perkin-Elmer), 2 μL (optimerad mängd)

5xRT-buffert, 1 μL

Taq-polymeras (5 units/μL, Perkin-Elmer), 0,1 μL

yttre primer 1 (1 pmol/μL)

yttre primer 2 (1 pmol/μL)

RNAsin: 1 μL (40 units)

Revers transkriptas: 1,0 μL (20 units)

RO-vatten, 24,9 μL

Till 40 μL av reaktionsblandningen sätts 2-3 droppar paraffinolja (Merck-KEBOLab)

Tillsättning av prov (“Preplab”)

• 10 μL prov tillsätts reaktionsblandningen under oljeskiktet.

Amplifiering I (“Apparatlab”)

Program för RT-PCR och första PCR-omgången med yttre primers:

43 °C 60 min, 94 °C 5 min 1 cykel (RT-PCR)

95 °C 1 min, 45 °C 1 min, 72 °C 3 min 19 cykler

Total tid ca 3 tim och 30 min.

Andra PCR-omgången ("nestning")

1 "rena rummet" blandas PCR reaktionslösning per rör enligt följande:

10 x PCR-buffert, 5 μL

dNTP-blandning (1,25 mmol/L av varje), 4 μL)

MgCl₂ (25 mmol/L Perkin-Elmer), 2 μL (optimerad mängd)

Taq-polymeras (5 units/μL), 0,2 μL

yttre primer 1(10 pmol/μL), 0,6 μL

inre primer 3 (10 pmol/μL), 0,6 μL

RO-vatten, 32,6 μL

Till 45 μL av reaktionsbiandningen sätts 2-3 droppar mineralolja

Amplifiering II

Program för andra PCR-omgången med primers 1 och 3:

95 °C 5 min, 55 °C 30 sek, 72 °C 1 min: 1 cykel

95 °C 30 sek, 55 °C 30 sek, 72 °C 1 min: 33 cykler

95 °C 30 sek, 55 °C, 30 sek, 72 °C 5 min: 1 cykel

Total tid ca 2 tim, 30 min.

Elektrofores

15 μL från det arnplifierade röret tas ut med mikropipett och blandas med 5 μL laddningsbuffert innehållande bromfenolblått och sukros. Blandningen appliceras på botten av brunnen. Samtidigt laddas en gel/storlekskontroll, dvs tidigare amplifierad produkt i en agarosgel. Elektroforesen får gå ca 1 tim vid max 100V (liten gel; GNA 100, Pharmacia) eller vid max 140V (stor gel; HORIZON 11-14; BLR Life Technologies, mc.). Gelen sänks ned i etidiumbromid-”färgbadet” (1 mg/L i 1/2x TBE-buffert) och får inkubera i dragskåp minst 15 min. Gelen avfärgas i RO-vatten i ca 5 min. Gelen fotograferas på UV-bord.

Kvalitetssäkring

Intern kvalitetskontroll

En reagenskontroll inkluderas som omfattar alla reagens utan annan tillsats. Negativ kontroll består av alla reagens och 10 μL RO-vatten. Negativ kontroll tas med efter vart fjärde prov. Två positiva interna kontroller inkluderas vid varje analystillfälle. Dessa utgörs av odlat echovirus 30 titrerat i sterilt RO-vatten och motsvarar 0,5 resp 0,05 TCID50. De positiva och negativa kontrollerna hanteras exakt såsom patient- proven och parallellt med dessa. Vid var sjätte körning inkluderas förutom echovirus 30 även positiva kontroller bestående av coxsackie B5- och A9-isolat. Två positiva kontroller av varje isolat inkluderas.

Krav för godkänd analys

Positiv kontroll skall visa band av rätt storlek och av adekvat styrka i agarosgelen. Inga negativa kontroller skall visa sådant band.

Duplikatanalyserna skall visa samstämmiga resultat. Utfaller analys med ett positivt och ett negativt resultat och analysomgången för övrigt är tillfyllest kan provet i angelägna fall preliminärsvaras av ansvarig virolog. Tolkning sker genom samdiskussion med patientansvarig läkare. Provet analyseras ånyo.

Åtgärd vid problem med kontrollerna

Om positiv kontroll ej är tillfredsställande kan endast positiva prov svaras ut. Samtliga prov analyseras ånyo.

Om negativa kontroller visar kontamination kan endast negativa resultat utsvaras. Ev positiva resultat svaras först om förnyad analys ger identiskt resultat.