Bilaga 5 (CNS)

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet

---

Bilaga 5

Enterovirus: Isolering enligt metod från Virusavdelningen, Huddinge sjukhus

Reagens

Isolering

• Rundbottnade rör med nästan konfluerande cellmatta används. Cellerna kan företrädesvis vara GMK (Green Monkey Kidney)-celler i kombination med RD (Rhabdomyosarkom)-celler.
• Före tillsättningen av likvor till röret avsugs utväxtmediet och ersätts med 1.5 mL uppehållsmedium som kan bestå av 80% Medium 199 (Parker) + 20% tryptosfosfatbuljong med tillsats av 2% fetalt kalvserum.
• Till varje cellrör ympas 0,2-0,4 mL likvor beroende på mängd insänt material. Om mycket litet provmaterial erhållits kan isoleringsförsök göras även på så lite som 0,05 mL. Känsligheten blir då lägre.
• Rören får sedan ligga horisontellt och snurra kontinuerligt i inkubator hållande 36-37 °C.
• Isoleringsförsöket pågår under 14 dagar och under den tiden inspekteras cellmattan 2 ggr/vecka i ljusmikroskop för att notera ev cytopatogen effekt. Inititalt ses en upprundning av cellerna vilka sedan lossnar och blir små fragmentariska bitar som flyter runt i mediet.

Verifiering

• Vid cytopatogen effekt bör passage göras för att bekräfta att effekten på cellmattan orsakas av replikerande virus och ej är toxisk till sin natur.
• Vid passage tas 0,1 mLav materialet i det positiva röret och sätts till ett nytt cellrör på samma sätt som vid ursprungsisoleringen.
• Passagen avläses dagligen i ljusmikroskop. Vid total cytopatogen effekt typisk för enterovirus ges följande svar: cytopatogent agens påvisat - sannolikt enterovirus.
• Det isolerade materialet förvaras vid -20 °C i väntan på typning.

För vissa coxsackie A-typer krävs isolering på nyfödda babymöss. Sådan utförs endast undantagsvis, varför metoden ej beskrivs här.

Typning

Typning av enterovirusisolat, vilket också ger den definitiva bekräftelsen på att ett enterovirus isolerats, kan göras enligt två olika principer; med komplementbindningstest och med neutralisationstest.

För komplementbindningstest används typspecifika antisera som framställts i marsvin. I en 96-hålsplatta sätts en droppe antiserum till varje brunn (olika serotyper i olika hål). Därefter tillsätts 2 droppar av den virusskörd man önskar typa. Inkubering sker över natt i närvaro av komplement och dagen efter tillsätts det hemolytiska systemet och plattan avläses. Med tillgång till marsvinsantisera kan serotypning ske inom två arbetsdagar.

För att rationalisera typning med neutralisations (NT)-test finns pooler med typspecifika antisera. Dessa togs fram av Lim och Benyesh-Melnick och kallas därför LBM-pOoler. Det finns allt som allt 15 olika pooler. De 8 första poolerna (A-H9) täcker in de 42 serotyper som oftast isoleras i cellkultur. 100 Tissue culture infectious doses (TCID)₅₀/0,1 mL av virusisolatet inkuberas med lika stor volym (20 units) av serumpoolen. Virus-serumblandningen ympas sedan på cellrör vilka inkuberas på samma sätt som vid primär isolering. Avläsning sker 2-3 ggr under 10 dagar. Beroende på vilka pooler som neutraliserat virus kan den aktuella serotypen utläsas med hjälp av ett schema.