Bilagor till VRE-diagnostiken
Artikel publicerad februari 2012. Texten är preliminär ännu ej godkänd genom konsensusförfarande
Till huvudartikeln Vankomycinresistenta enterokocker (VRE), referensmetodik
Bilagor till VRE-diagnostiken
Bilaga 1
Diagnostiska minimikriterier för artdiagnostik av enterokocker (referensmetodik)
- Enterococcus spp: Minimikriterier: Typisk kolonimorfologi (gråvita kolonier på blodagar, kan ha ingen hemolys, alfa- eller betahemolys, oftast gula kolonier på CLED-agar), katalasnegativa grampositiva kocker i par eller korta kedjor, PYR- och eskulin-positiva. Ytterligare egenskaper för enterokocker är förmåga att växa i buljong med 6,5 % NaCl, positiv i agglutinationstest för Lancefields grupp D.
För diffentiering av enterokocker se (Tabell 4)
Bilaga 2
Anrikningsmedium för VRE-screening
- Galla-eskulinbuljong (Referenssubstrat):
- Typexempel Bile Esculin Azide Broth (Biolife) 42.7 g/L
- Innehåll------ Gram/L
- Trypton -------17
- Pepton --------3
- Jästextrakt------ 5
- Oxgalla-------- 10
- Natriumklorid------ 5
- Natriumcitrat------ 1
- Eskulin---------- 1
- Fe-ammonium-citrat------ 0,5
- Natriumazid-------0,25
- pH 7.1± 0.2
Galla-eskulinbuljong tillreds enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt vankomycin 4 mg/L och aztreonam 60 mg/L.
- Alternativ anrikningsbuljong (Todd-Hewittbuljong)
- Typexempel:T-H-buljong (BD)
- Innehåll --------Gram/L
- Infusion av kött------ 3,1
- Neopepton------20,0
- Dextros------ 2,0
- Natriumklorid------ 2,0
- Dinatriumfosfat------ 0,4
- Natriumkarbonat------ 2,5
- pH 7,8± 0.2
Todd-Hewittbuljong tillreds enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt vankomycin 4 mg/L och aztreonam 60 mg/L.
Bilaga 3
PCR-metod för påvisande av van-gener
vanA och vanB PCR för LightCycler (FRET-hybridiseringsprobe)
Reaktionsvolymen är 20 μL varav 5 μl är templat. PCR mixen innehåller 1xHYB- master (Roche Diagnostics), 2 mM MgCl2, 1 μM av varje primer och 0.2 μM av varje hybridiserings-probe.
- Temperaturprofil LightCycler
- Enzymaktivering: 95 °C 10 min. Slope 20 °C/s. 1 cykel.
- Amplifiering: 95 °C 15 sek, 50 °C 15 sek, 72 °C 25 sek. 40 cykler. Slope 20 °C/s.
- Kylning: 40 °C 60 sek. Slope 20 °C/s.
Avläsning med color compensation. VanA och vanB avläses i olika kanaler.
Smältpunktanalys behövs inte.
VanA och vanB PCR för Rotor-Gene (TaqMan probe)
Reaktionsvolymen är 20 μL varav 2 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x perfeCta qPCR FastMix (Quanta bioscience), 0,2 μM av varje primer, 0,075 μM av varje Taqman-probe.
- Temperaturprofil för Rotor-Gene
- Enzymaktivering: 95 °C i 3 min
- Amplifiering: 95 °C i 3 sek, 60 °C i 20 sek. 40 cykler.
VanA och vanB avläses i olika kanaler. Smältpunktanalys behövs inte.
PCR-metod för molekylärbiologisk verifiering av E. faecalis och E. faecium
DdlE-PCR för LightCycler: Reaktionsvolymen är 20 μL varav 4 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x LC- master, 4 mM MgCl2, 0,5 μM av varje primer och 0,04 units/μL FastStart Taq DNA-polymeras.
LC-master innehåller 2x FastStart PCR-buffert (Roche diagnostics), 4 % DMSO (Sigma), 0,4 mM dNTP (Roche diagnostics), 0,2 mg/mL BSA (Roche diagnostics) och 1,2x SybrGreen I (Molecular Probes).
- Temperaturprofil LightCycler
- Enzymaktivering: 95 °C 10 min. Slope 20 °C/s. 1 cykel.
- Amplifiering: 95 °C 15 sek, 54 °C 10 sek, 72 °C 25 sek. 35 cykler. Slope 20 °C/s.
- Smältpunktsanalys: 60–90 °C. Slope 0,1 °C/s
- Kylning: 40 °C 30 sek. Slope 20 °C/s.
Avläsning: Metoden är en cybergreenmetod och läses av i våglängd 530 nm. Positiva prov ska uppvisa en amplifieringskurva samt att produkten ska ha en smälttopp runt 84–85 °C.