Campylobacter-laboratoriediagnostik
Huvudartikel: Campylobacter
Laboratoriediagnostik av Campylobacter species
Allmänt
Eftersom Campylobacter växer långsammare än annan tarmflora krävs selektiva medier innehållande antibiotika.
De Campylobacter-arter som är vanligast hos människa växer bäst vid 42 °C i mikroaerofil miljö bestående av 3 %-15 % O2 och 1-10 % CO2. Inga otvetydigt kostnadseffektiva anrikningsförfaranden har beskrivits.
Vissa species som C. upsaliensis är känsliga för antibiotika som ingår i de selektiva medierna. För isolering av sådana förordas filtreringsmetodik. Campylobacter passerar genom filter med porstorlek 0,45-0,65 μm, till skillnad från de flesta andra tarmbakterier.
Beskriven referensmetodik inriktas i första hand på diagnostik av C. jejuni/coli som är vanligast i Sverige.
Som ett komplement beskrivs också referensmetodik för andra species som framkallar diarré hos människa.
Campylobacter jejuni/coli
Referensmetodik
Referenssubstrat
Blodfri selektiv campylobacteragar Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat. Substratets selektivitet beror på tillsats av antibiotika (cefoperazone 32 mg/L, amfotericin B 10 mg/L) och deoxycholat vilka hämmar de flesta grampositiva bakterier och även de flesta av tarmens gramnegativa bakterier. En tillsats av kristallviolett hämmar grampositiva bakterier och jäst. Substratet har validerats mot blodhaltig campylobacteragar och befunnits ge likvärdiga resultat till ett lägre pris. Andra antibiotikakombinationer innehållande cefalotin kan hämma Campylobacter och bör därför undvikas.Ursprungligt substrat enl. Skirrow beskrivs i Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat.
Isolering av Campylobacter jejuni/coli
Provmaterial stryks ut på campylobacteragar och sekundärstryk görs med steril ögla. Inkubera plattan mikroaerofilt 42 °C i 2 dygn (optimal växt i en atmosfär som innehåller 7 % O2 d.v.s. ca 1/3 av normal syrespänning och 10 % CO2, resten N2). Lämplig atmosfär kan uppnås genom att evakuera en anaerobklocka utan katalysator till 1/3 och ersätta med en koldioxid-kvävgas blandning eller med hjälp av kommersiella gasgenererande kits. En studie utförd vid lasarettet i Falun gav vid handen att fler Campylobacter isolerades med Anoxomatutrustning än med klockor och Campy Pak.
Avläsning sker efter 1 och 2 dygn.
Misstänkta kolonier är vanligen genomskinliga, grå till metallglänsande; ibland med ett karakteristiskt utflytande/svärmande växtsätt och ibland små och toppiga. I de fall enskilda kolonier bildats har de ojämna och utflytande kanter.
Andra Campylobacter species
Referensmetodik
Referenssubstrat
Blodfri campylobacteragar utan antibiotika.
Isolering
- C. upsaliensis växer bra vid 42 °C men hämmas av antibiotika.
- C. fetus växer dåligt vid 42 °C. Vid särskild misstanke odlas provet vid 37 °C.
- C. hyointestinalis är beroende av H2 för växt.
- C. lari förväntas växa under samma betingelser som C. jejuni/coli.
Vid filtrering rekommenderas cellulosaacetat-membranfilter med 0,65 μm por-storlek. Filtret placeras på antibiotikafritt medium. 10-15 droppar fecessuspension placeras på filtret och plattan inkuberas i 37 °C en timme, varefter filtret tas bort och plattan reinkuberas i mikroaerofil miljö innehållande 7 % O2, 10 % CO2 och 6 % vätgas balanserat med N2 i 37 °C.
Avläs efter 1 och 2 dygn
Identifiering och minimikriterier
Säkrast skiljs species åt med molekylärgenetisk metodik. Verifiering av genus Campylobacter kan göras med användning av flaA genen i PCR. För identifiering till speciesnivå utnyttjas 16S rRNA analys [Fig. 13].
Övrig diagnostik
Misstänkta kolonier verifieras rutinmässigt oftast genom mikroskopi, omspridning med och utan mikroaerofil miljö samt biokemiska test. Ofta utlämnas omspridning vid typiska fynd.
Mikroskopering
Campylobacter är gramnegativa, lätt böjda stavar med ”måsvingeutseende”. Stundtals kan de uppträda som kockoida eller korta stavar.
Vid omodling på selektiv campylobacteragar i mikroaerofil miljö 42 °C resp. aerob miljö 42 °C förväntas Campylobacter växa endast på plattan som inkuberats i mikroaerofil miljö.
Campylobacter är typiskt långsamt oxidaspositiva och katalaspositiva.
Med dessa kriterier uppfyllda kan isolat från människa anses identifierat som C. jejuni/coli. Den förenklade metodiken skall valideras mot referensmetoden.
Det bör dock framhållas att C. lari i stort påminner om C. jejuni och C. coli och att ovan beskrivet protokoll inte utesluter C. lari speciellt vid negativt hippurattest.
Campylobacter jejuni och coli kan skiljas åt med hippurattest (positiv resp. negativ reaktion). Hippuratnegativa varianter av C. jejuni finns beskrivna men inga andra species än C. jejuni är hippuratpositiva varför specificiteten är hög. Hydrolys av natriumhippurat kan påvisas i rörtest ( ASM Manual of Clinical Microbiology 7th ed. p. 1668) eller med disk och tjockt inokulat. Påvisande av hipO (hippuricas) genen med PCR kan också användas.
Direktmikroskopi
Tack vare typisk morfologi kan Campylobacter identifieras i mikroskop på fecesmaterial från patienter med akut enterit. Förfarandet kan användas i utvalda fall där infektion med andra species än Campylobacter jejuni/coli misstänks.
Nukleinsyradetektion
För direkt diagnostik av Campylobacter i feces med PCR saknas för närvarande tillräcklig erfarenhet, men skulle teoretiskt kunna underlätta påvisandet av andra arter av Campylobacter än C. jejuni/coli.
Kommersiella metoder finns ej tillgängliga.