Cellodling Chlamydia trachomatis-bilaga2

Den utskrivbara versionen stöds inte längre och kanske innehåller renderingsfel. Uppdatera din webbläsares bokmärken och använd standardutskriftsfunktionen istället.

Huvudartikel: Klamydia

Sekundärartikel till: Klamydia-laboratoriediagnostik

Primärisolering och identifiering av Chlamydia trachomatis med cellodling (modifierad från Ripa & Mårdh (1)

Substratrecept

Cellslag

Mykoplasmafria McCoy-celler med dokumenterad förmåga att vara värdcell för förökning av C. trachomatis används. Regelbunden kontroll för mykoplasmakontamination med PCR eller mykoplasmaodling rekommenderas.

Metod för primärisolering

För cellpropagering och spädning av prov används RPMI 1640 med tillsatser enligt recept 2.1.2 ovan.

Efter provsättning kompletteras detta medium med glukos och cykloheximid enligt recept 2.1.3. Observera att ny uttitrering av lämplig cykloheximidkoncentration (0,5-2,0 mg/L) bör göras vid varje ny beredning av cykloheximid. Likaså bör cykloheximidkoncentrationen uttitreras vid cellbyte. Denna uttitrering görs med kontroller enligt nedan och cykloheximidkoncentrationer 0,5-2,0 mg/L i 0,5 mg steg.

Cellodlingsförfarande enligt gängse normer. Cellerna kan propageras på 250 mL plastflaskor eller större plast- eller glasflaskor efter behov. Celler för provsättning passeras efter 2-4 dagar i täthet 1,5-2x10 $^{5}$ celler/mL (den erforderliga celltätheten beror på hur snabbt cellerna växer ut till ett konfluerande lager – för exakt inokulation räknas cellerna i Bürkerkammare). Till varje brunn i 24-håls cellodlingsplattor sätts 1 mL cellodlingsmedium med celler. Cellsuspensionen ska efter 1 dygns inkubering ge ett konfluerande cellager.

Provsättning

Upptining av prov som varit frysta bör ske snabbt (37 °C vattenbad). Transportröret med isittande provtagningspinne skakas i Vortex, eventuellt med cirka 10 glaspärlor i röret. Grumliga prov (i allmänhet cervix) spädes med cellodlingsmedium 1:1, och centrifugeras 2-300xg, 5 min. Från varje prov sätts till 2 brunnar: 0,5 mL ospätt prov + 0,5 ml cellodlingsmedium eller 1 mL spätt prov. Resten av provet fryses åter vid -20-70 °C.

Vid varje analystillfälle sätts även positiv och negativ kontroll. Plattorna centrifugeras vid 3000xg, 37 °C i 1 timme. Plattorna inkuberas sedan vid 37 °C i 2 timmar,CO₂-termostat. Därefter byts till provsättningsmedium och plattorna inkuberas vid 37 °C i 2 dygn i CO₂-termostat.

Färgning

Medium avsugs från varje brunn. Cellerna fixeras i 1 mL 95 % etanol i 10 min. Etanolen hälls av. Cellerna färgas med fluoresceinmärkta monoklonala antikroppar mot C. trachomatis enligt fabrikantens instruktion. Avläsning sker i UV-mikroskop med filterkombination för fluoresceinisotiocyanat. För översiktsavläsning används x10 objektiv och för verifiering av misstänkt inklusion x40. En typiskt fluorescerande inklusion per brunn är tillräckligt för att ange provet som positivt. Den tidigare använda jodfärgningen ger lägre diagnostisk känslighet genom att färre typiska inklusioner ses i cellmattan (2)

Kontroller

Den positiva kontrollen titreras i provtagningsmedium så att ett visst antal inklusioner, exempelvis 5 per x10 synfält, ses vid upprepade provsättningar. Om större avvikelser uppträder mellan olika analystillfällen, inklusive om inga inklusioner ses, byts positiv kontroll och/eller McCoy celler och orsak till avvikelsen klarläggs. Byte av McCoy celler, oavsett utfall av ovanstående kontroller, rekommenderas efter 6-8 veckor.

”Blind passage”

Prov som är negativa vid ovanstående färgning: Plattorna inkuberas ytterligare 1 dygn, dvs sammanlagt 3 dygn. Medium hälls av och 0,5 mL provtagningsmedium sätts till den inokulerade icke färgade brunnen för varje negativt prov. Cellerna skrapas loss med en pasteurpipett och förs över till en ny brunn med McCoy-celler. 0,5 mL cellodlingsmedium tillsätts. Därefter inkuberas och färgas cellerna som ovan. Genom denna ”blinda passage” kan sensitiviteten av odlingen ökas.

Referenser

1. Ripa, KT och Mårdh, P-A. Cultivation of Chlamydia trachomatis in cycloheximid-reated McCoy cells. J Clin MIcrobiol 1977, 6:323-331.

2. Stamm, WE et al. Detection of Chlamydia trachomatis inclusions in McCoy cell cultures with fluroescein-conjugated monoclonal antibodies. J Clin Microbiol 1983, 17:666-668.