Arvsmassans struktur och funktion
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik
Arvsmassans struktur och funktion[redigera]
Alla levande celler och viruspartiklar innehåller arvsmassa, genetisk information, i form av nukleinsyran DNA, deoxyribonucleic acid (flercelliga organismer och encelliga mikroorganismer samt virus) eller RNA, ribonucleic acid (en del virus). I eukaryota celler (hos djur, parasiter, växter och svampar) är DNA organiserat i linjära kromosomer i en cellkärna. Arvsmassan är skyddad av olika typer av interna strukturer och membran och en cellvägg av cellulosa/lignin hos växter eller av kitin hos svampar. Djurceller saknar cellvägg. En del arvsmassa finns också organiserad i organellerna, mitokondrier och kloroplaster (växtcell), se figur 1.
Hos prokaryota organismer (bakterier) som saknar cellkärna återfinns DNA i en oregelbunden form, nukleoid, i cytoplasman i cellen. Bakteriers genom består vanligen av en cirkulär kromosom och eventuellt också extrakromosomalt genetiskt material, i form av plasmider, medan virus har cirkulära eller linjära genom. Bakteriecellerna är oftast omslutna av en cellvägg bestående av peptidoglykan med teikonsyra i flera lager (grampositiva bakterier), peptidoglykan i få lager med LPS och lipoproteiner (gramnegativa bakterier), S-lager av protein, kapsel eller slemlager, se figur 2. Vissa bakterier saknar helt cellvägg (t ex. genus Mycoplasma) eller kan bilda endosporer för att vara vilande under mycket lång tid (t ex. Bacillus anthracis som orsakar mjältbrand och Clostridium tetani som orsakar stelkramp).
Viruspartiklar omsluts av ett ytterhölje av protein kallat kapsid, ibland även ett hölje av lipider från värdcellens membran.
Arvsmassan innehåller all information som behövs i cellerna för att tillverka de komponenter som krävs för cellernas funktion, dvs olika typer av RNA och proteiner. Gener är de delar av en DNA-molekyl som innehåller genetisk information, medan andra delar av molekylen har mer strukturella ändamål eller är involverade i regleringen av generna.
DNA-molekylen är uppbyggd av socker (deoxyribos), fosfatmolekyler och repeterade enheter kallade kvävebaser, baser eller nukleotider. På varje socker i ”ryggraden”, riktade mot mitten av den dubbelsträngade molekylen, sitter en av de fyra baserna Adenin, Tymin, Guanin, Cytosin (A, T, G eller C), bundna, se figur 3. Baserna hålls ihop med vätebindningar och A binder till T med två vätebindningar och G till C med tre vätebindningar. Baserna är komplementära vilket innebär att all information i den ena strängen finns kopierad i den andra. Molekylen är en tvinnad dubbelhelix i form av en högervriden spiral, och koden i de båda strängarna läses åt motsatt håll, dvs molekylen är "antiparallell". DNA-molekylen har asymmetriska ändar kallade 5’ och 3’, som även används för att markera riktningen på de båda strängarna. De båda strängarna i DNA-molekylen kan separeras genom att vätebindningarna mellan baserna bryts, med exempelvis värme. Mängden av kvävebaserna G/C i förhållande till A/T i DNA avgör hur hårt de båda strängarna sitter ihop. Den temperatur som behövs för att dela strängarna åt (dvs bryta vätebindningarna) kallas smälttemperatur (Tm, melting temperature). Fosfatgrupperna sitter på utsidan av molekylen och vilket medför att DNA är vattenlösligt. En av skillnaderna mellan RNA och DNA är att sockret deoxyribos bygger upp ryggraden i DNA medan RNA är uppbyggt av sockret ribos. RNA är enkelsträngat i cellerna medan DNA är dubbelsträngat. Biologiskt aktiva RNA-molekyler som transfer-RNA (tRNA) och ribosomalt RNA (rRNA) basparas till en dubbelhelix i cellerna där den tredimensionella strukturen är mycket viktig för dess funktion. En annan skillnad mellan RNA och DNA är att basen Uracil (U) ersätter basen T i RNA-molekylen.
Den levande organismens hela genom (totala genuppsättning) finns samlad i arvsmassan i varje cell. Ordningsföljden, sekvensen, av de fyra baserna i molekylen bildar den genetiska koden som innehåller informationen i cellerna. Denna kod är universell, vilket innebär att alla organismer inkluderande virus har en genetisk kod som är uppbyggd på principiellt samma sätt. Denna kod används för att bestämma den sekvens av aminosyror som bygger upp enzymer och övriga proteiner i cellerna.
De två centrala processerna i cellen då DNA läses av för att översättas till en aminosyrasekvens kallas transkription och translation. Vid transkriptionen kopieras DNA-sekvensen av enzymet RNA-polymeras till en RNA-kopia, messenger-RNA (mRNA), som sedan med hjälp av tRNA översätts till en aminosyrasekvens i ribosomen vid den så kallade translationen. Ribosomen är uppbyggd av RNA, rRNA, och generna som kodar för detta ribosomala RNA är väl konserverade hos olika arter och kan därför användas för att bestämma släktskapsförhållanden mellan organismer.
Varje aminosyra kodas av en triplett av baser (kodon). Den ena av strängarna i DNA-molekylen svarar för mRNA och översättning till protein. Denna sträng kallas sense medan den andra strängen som inte översätts betecknas antisense. Båda strängarna kan innehålla sense-och antisensesekvenser. Främst i virus och plasmider utnyttjas överlappande gener som läses över varandra åt var sitt håll. Bakterier utnyttjar detta för regleringen av gener medan virus utnyttjar det för att få plats med så mycket information som möjligt samtidigt som hela arvsmassan, genomets, storlek minimeras.
Vid celldelning kopieras hela genomet. Flera enzymer hjälps åt att vinda upp DNA-molekylen så att DNA-polymeras kommer åt att läsa den ena strängen i riktning 5’-3’ och sedan inkorporera komplementära baser i den nytillverkade strängen. Målsekvensen som kopieras kallas för templat. Den nya strängen basparar till den gamla och ger en dubbelhelix som har en ny och en gammal sträng (semikonservativ replikation), se figur 4.
Uppbyggnaden av nukleinsyra hos mikroorganismer varierar. Svampar och parasiter har dubbelsträngat DNA ordnat i flera linjära kromosomer. Bakterier har dubbelsträngat DNA ordnat i en cirkulär kromosom. Virus presenterar flera olika varianter inklusive dubbelsträngat DNA (dsDNA hos exempelvis Herpesvirus), enkelsträngat DNA (ssDNA hos exempelvis Parvovirus B19), dubbelsträngat RNA (dsRNA) och enkelsträngat RNA (ssRNA hos exempelvis luftvägsvirus, gastroenteritvirus och retrovirus).
På mikrobiologiska laboratorier används allt oftare specifika och känsliga metoder för påvisning av mikrobiell nukleinsyra i kliniska prover för att detektera mikroorganismer, toxingener eller resistensgener. Tekniker att studera arvsmassan kan också användas för epidemiologisk typning i exempelvis utbrottsutredningar. Nya metoder för kopiering och detektion av målsekvenser i arvsmassan utvecklas hela tiden. Begreppet NAAT, Nucleic Acid Amplification Techniques, används ofta i litteraturen och syftar på metoder där nukleinsyra används som templat, mål-DNA, för mångfaldigande av målsekvens (målamplifiering) eller signal (signalamplifiering). Metoderna efterliknar den naturliga kopieringen av arvsmassan som sker vid celldelning. De vanligaste metoderna baserade på målamplifiering, är Polymerase Chain Reaction (PCR), Ligase Chain Reaction (LCR), Strand Displacement Amplification (SDA), Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) och Transcription Mediated Amplification (TMA). Signalamplifiering baseras på att indirekta markörer, oftast fluorescerande prober, amplifieras och ger en ökande signal. Till denna kategori hör bland annat branched DNA technologies (bDNA) och Invader assays. Flera av de molekylärbiologiska metoder som används för mikrobiologisk diagnostik och epidemiologisk typning presenteras i denna bok.
REFERENSER[redigera]
- 1. Molecular microbiology: diagnostic principles and practice. Editors David H Persing et al. ASM Press, Washington DC, 2004.