Visa källa för Bilaga 1c. Biokemiska referenssubstrat för testbatteri vid identifiering av bakteriella tarmpatogener

'''Artikel publicerad april 2012. Innehållet preliminärt i väntan på konsensusförfarande''' 
----
''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik: Tarminfektioner]]''
----
==Biokemiska referenssubstrat för identifiering av ''Salmonella, Shigella'' och ''Yersinia'' i rutindiagnostiken==
===Allmänt===
Nedan beskrivna substrat kombineras till ett testbatteri lämpat för primär diagnostik av ''Salmonella, Shigella'' och ''Yersinia''.
Referenskombination för diagnostiken är Mannitolrör med Durhamrör, medier för påvisning av Lysindekarboxylas och H<sub>2</sub>S-produktion, Urea och ONPG/indol. Batteriet kan kompletteras med substrat för påvisande av ornitindekarboxylas (OD) som är användbart vid misstanke om ''Salmonella'' Typhi som bland ''Salmonellae'' är ensam att vara OD-negativ. Diagnosen ''Shigella sonnei'' stärks av påvisandet av OD-positivitet, övriga ''Shigellae'' är OD-negativa.

===Medium med D-mannitol===
Medium för differentiering av arter inom ''Enterobacteriaceae'' som påvisar förmåga att degradera D-mannitol (en av sex naturligt förekommande sockeralkoholer med sex kolatomer) med eller utan gasutveckling. 

Bakterier inom familjen kan utnyttja mannitol som kol-och energikälla. Mannitol internaliseras i bakteriecellerna och fosforyleras genom ett mikrobiellt fosfotransferassystem. Därefter sker en enzymatisk konvertering via ett dehydrogenas varvid molekylen omvandlas till D-fruktos under syrabildning. D-fruktos metaboliseras sedan vidare under avgivande av metabol energi. Vid processen bildar vissa mikroorganismer också gas, vilket kan studeras genom att i jäsningsröret applicera ett Durham-rör. 


'''Typrecept medium med D-mannitol'''
{| class="wikitable"
|-
! Innehåll!! Mängd
|-
| BACTO Pepton|| 10,0g
|-
| NaCl|| 5,0g
|-
| di-Na-vätefosfat-dihydrat || 5,0g
|-
| Bromtymolblått 2g/kg|| 12,0 mL
|-
| D-Mannitol Analytical Reagent|| 5,0g
|}


Sätts till RO-vatten, 1000mL

pH justeras till 7,4+-0,2 och dispenseras i 3,5 mL glasrör med Durhamrör 

Hållbarhet: 4 veckor i kyl
*Kontrollstammar
**''Escherichia coli'', CCUG 17620
**''Proteus mirabilis'', CCUG 26767


===Lysindekarboxylas (LD)- och H<sub>2</sub>S-medier ===

Medier för påvisande av lysindekarboxylasaktivitet och H<sub>2</sub>S-bildning hos bakterier tillhörande ''Enterobacteriaceae''. Förekomst av både lysindekarboxylas och enzymsystem för att reducera tiosulfat eller sulfit till H<sub>2</sub>S (flera gener, ''phs, chlA'', och ''menB'', är involverade) är en framträdande egenskap hos många ''Salmonellae'', men kan också förekomma hos andra bakteriearter. 

Bakterier som producerar lysindekarboxylas dekarboxylerar aminosyran ''lysin'' i mediet under bildandet av basiska produkter (främst ''kadaverin''). LD-buljongen antar då lila färg (beroende på vilken indikator som används). För bakterier som saknar LD förblir mediet surt (gulfärgat) beroende på bakteriernas metabolism. Kommersiella buljonger finns tillgängliga. Lysinet i mediet kan bytas mot ''ornitin'' för påvisande av ortnitindekarboxylas (OD).

Ett traditionellt referensmedium för påvisande av H<sub>2</sub>S-bildning hos bakterierna är kombinationsmediet Triple Sugar Iron (TSI)-agar som kan tillverkas som snedagar i buljongrör. Mediet innehåller glukos (såväl syrabildning som gasproduktion kan påvisas i botten av röret), laktos och sukros (färgar i förekommande fall hela mediet gult av bakteriemetabolism). Produktion av H<sub>2</sub>S genom reduktion av tiosulfat framträder som svärta i mediet. Kommersiella buljonger finns tillgängliga.
 
Kombinationsmedium (Lysindekarboxylas (LD)-buljong med järn-ammoniumsulfat och tiosulfat) kan användas för att påvisa samtidig förekomst av lysindekarboxylas-och sulfhydrasaktivitet hos ''Salmonella''. Mediets pH höjs beroende på LD-aktiviteten, särskilt effektivt om reaktionen sker anaerobt (för att undvika pH-sänkning orsakad av bakteriens aeroba metabolism).  Om bakterien samtidigt producerar vätesulfid (H<sub>2</sub>S) från tiosulfatet,  kan detta reagera med järnet och bilda en svart, svårlöslig järnsulfid. Om bakterien inte producerar lysindekarboxylas sjunker mediets pH successivt beroende på glukosmetabolism och antar en gul färg. Mediet förblir då gult även om bakterierna har sulfhydrasaktivitet. Nedan visas recept för ett kombinationsmedium.


'''Kombinationsmedium för påvisning av LD-H<sub>2</sub>S'''
{| class="wikitable"
|-
! Innehåll!! Mängd
|-
| LD-buljong (kommersiell)|| 14,0g
|-
| Agar-granulat|| 6,0g
|-
| ammonium-järn(II)-sulfat-hexahydrat || 0,2g
|-
| Na-tiosulfat-pentahydrat|| 0,2g
|-
| NaCl|| 5,0g
|}


Sätts till RO-vatten, 1000mL

pH justeras till 6,1+-0,2 och dispenseras i 3,5 mL glasrör  

Hållbarhet: 4 veckor i kyl
*Kontrollstammar
**''Escherichia coli'', CCUG 17620
**''Proteus mirabilis'', CCUG 26767
**''Salmonella'' Typhimurium, CCUG 31969

===Urea-buljong===

Medium för differentiering av gramnegativa stavar.

Vissa bakterier producerar enzymet ureas (bland andra ''Proteaee, Yersinia'' spp), vilket hydrolyserar urinämne under bildning av ammoniak och koldioxid. Ammoniak löser sig i mediet som blir basiskt varvid närvarande indikator (fenolftalein) slår om till rött.

[[Fil:Ureabild.jpg|thumb|center|500px| Omvandling av urea till ammoniak via mikrobiellt ureas]]



'''Typrecept Urea-buljong'''
{| class="wikitable"
|-
! Innehåll!! Mängd
|-
| Pepton|| 14,0g
|-
| Glukos|| 6,0g
|-
| Di-natrium-fosfat|| 0,2g
|-
| Kalium-dihydrogen-fosfat|| 0,2g
|-
| NaCl|| 5,0g
|-
| Fenolrött|| 0,004g
|-
| Urea 40 %|| 1 ampull (5 mL)/95, 0 mL medium
|}


Sätts till RO-vatten, 950mL

pH justeras till 6,8+-0,2 och dispenseras i 3,5 mL glasrör  

Hållbarhet: 4 veckor i kyl
*Kontrollstammar
**''Escherichia coli'', CCUG 17620
**''Proteus mirabilis'', CCUG 26767

===ONPG-Indol-medium===

Oto-nitrofenyl-β-galaktosid (ONPG) är en substans som kan användas för detektion av beta-galaktosidaseaktivitet hos bakterier.  Enzymet hydrolyserar ONPG-molekylen till galaktos och orto-nitrofenol, den senare molekylen gulfärgar mediet. Beta-galaktosidas krävs för att bakterier ska kunna hydrolysera laktos som är det egentliga målsubstratet för enzymet. För att kunna hydrolysera laktos krävs att detta internaliseras i bakterierna, vilket sker via ett mikrobiellt permeas som finns hos många medlemmar av familjen ''Enterobacteriaceae''. Dessa blir då i testsystem laktospositiva. Vissa bakterier saknar permeas och är då laktosnegativa, men kan ändå vara ONPG-positiva. Exempel är många stammar av ''Salmonella arizonae''. De flesta övriga ''Salmonellae'' är såväl laktos som ONPG-negativa. 

Till mediet kan också sättas aminosyran L-tryptofan som utnyttjas för påvisandet av indolproduktion. Positiv indoltest är klassisk för ''E. coli'' men förekommer även hos andra bakterier. Bakteriellt tryptofanas-enzym deaminerar tryptofan under bildande av indol, pyrodruvsyra och ammoniak. Indolet påvisas med en kemisk reaktion mellan indol och  p-dimetylaminobenzaldehyd (ingrediens i Kovacs reagens som finns kommersiellt tillgänglig), varvid vid lågt pH ett rött färgämne, rosindol, bildas.


'''Typrecept ONPG-Idol-medium'''
{| class="wikitable"
|-
! Innehåll!! Mängd
|-
| 2-nitrofenol-beta-D-galaktopyranosid|| 1,5g
|-
| di-natriumvätefosfat-dihydrat|| 0,447g
|-
| neutraliserad bakteriologisk pepton|| 7,5g
|-
| NaCl|| 3,75g
|-
| L-tryptofan|| 0,75g
|}


Sätts till RO-vatten, 1000mL

pH justeras till 7,4+-0,2 och dispenseras i 3,5 mL glasrör  

Hållbarhet: 4 veckor i kyl
*Kontrollstammar
**''Escherichia coli'', CCUG 17620
**''Proteus mirabilis'', CCUG 26767

==REFERENSER==
*Marie-Louise Danielsson-Tham. ''Några vanliga biokemiska tester inom bakteriologin''. Andra reviderade upplagan. Publicerad 1985.
*Flera tillkommer...

[[Kategori: Infektioner i mage och tarm]]
[[Kategori:Smittskyddslagens sjukdomar]]