Bilaga 6 Mykobakterier; substrat-och reagensrecept

Sekundärartikel till Tuberkulos-laboratoriediagnostik

Mykobakterier; substrat- och reagensrecept[redigera]

Löwenstein-Jensen medium[redigera]

(OBS! 3 tillverkningsdagar)

Dag 1
- 1. Lutlösning, saltlösning och malakitgröntlösning prepareras (se nedan).
Dag 2
- 1. Ägg (32 st per hel sats) placeras i hinkar.
- 2. Lutlösningen hälls över äggen (glasögon och handskar).
- 3. Efter 3 timmar hälls lutlösningen av, varefter äggen sköljs med rinnande vatten i 4 timmar.
- 4. Vattnet hälls av och äggen får stå i kyl 4 ºC över natten.
Dag 3
- 1. Äggen tas upp med sterila handskar och slås upp, ett i taget, i en steril bägare. Kontrollera att inget är skämt. Äggen vispas ihop med en steril visp. 1340 mL ägglösning hälls ned i en steril 5 L E-kolv och skakas i skakmaskin 10 minuter.
- 2. En sats saltlösning och 26 mL malakitgröntlösning tillsätts.
- 3. Skakas i skakmaskin 10 minuter. Blandningen filtreras genom gasväv (steril) och får vila i 20-30 minuter.
- 4. Dispenseras i sterila odlingsrör.
- 5. Mediet koaguleras i värmeskåp 80-85 ºC 1 timme.

Lutlösning:
- Till 2 hinkar med 8-10 L vatten tillsätt
  - ≈ 100 mL lutpastiller NaOH, som får lösa sig till följande dag.

OBS! Glasögon och handskar måste användas vid hanteringen av lutlösningen.

Saltlösning
- Kalium-di-vätefosfat KH₂PO₄ ---- 3,2 g
- Magnesiumfosfat MgSO₄x7H₂O ---- 0,32 g
- Tri-Magnesium-dicitrat C₁₂H₁₀Mg₃O₁₄x14 H₂O ---- 0,8 g
- L-Aspargin ---- 4,8 g
- Glycerol ---- 16,0 mL
- 1 M HCl ---- 50,0 mL
- Avjoniserat vatten ---- 700,0 mL

1. Saltlösningen vägs upp i 1500 mL E-kolv.
2. Värms till nästan kokpunkt.
3. 40 g potatisstärkelse löses i 100 mL avjoniserat vatten.
4. Stärkelselösningen tillsätts under omskakning.
5. Autoklaveras i 20 minuter, 120 ºC.
6. Efter autoklavering förvaras kolvarna i rumstemperatur.

Malakitgrönt 2 % lösning
- Malakitgrönt-oxalat ---- 3,0 g
- Avjoniserat vatten ---- 150 mL

1. Malakitgrönt-oxalat vägs upp i 300 mL glasflaska.
2. Avjoniserat vatten tillsätts.
3. Flaskan placeras i vattenbad med kokande vatten.
4. Flaskan skakas då och då tills pulvret gått i lösning.

Reagens för dekontaminering av prov[redigera]

NALC och NaOH
- A. 4% NaOH ----- 500 mL
- B. 2.9 % natriumcitrat dihydrat eller 2.6 % vattenfri natriumcitrat ----- 500 mL
- C. NALC (tillverka dagligen) ----- 5 g
- D. pH 6,8 fosfatbuffert (eller sterilt destillerat vatten)

Blanda A och B, sterilisera och förvara för användning senare. Tillsätt reagens C strax innan användning. Förbrukas inom 24 timmar.

Natriumlaurylsulfatlösning
- Natrium laurylsulfat 99,9 % ---- 45 g
- Avjoniserat vatten ---- 1500 mL
- Natriumhydroxid, NaOH ---- 15 g

Laurylsulfatet löses i ca 60 ºC vatten, NaOH tillsätts innan utfällningen börjar. Använd mycket rena kärl. Fylls med ca 750 mL på 1 liters flaskor och autoklaveras i 120 ºC i 20 min. Ställs i 37 ºC termostat snarast.

Neutralisationslösning för dekontaminering
- Svavelsyra H₂SO₄ konc. (98 %)---- 0,9 mL
- Avjoniserat vatten ---- 1000 mL
- Bromkresolpurpur 1 % ---- 0,8 mL

Blandas, fylles med ca 1000 mL på 1 liters flaskor. Autoklaveras 120 ºC i 20 minuter.

Reagens för fluorescensmikroskopi[redigera]

Auramin
- Auramin ---- 3,0 g
- Fenol ---- 32 mL
- H₂O ---- 968 mL

Syra-alkohol lösning.
- 3,0 mL koncentrerad HCl adderas långsamt till 97,0 mL 90-95 % etanol (stark värme kan utvecklas).

Reagens för Hallbergfärgning[redigera]

Stamlösningar
- Nachtblaulösning
- Nachtblau ---- 5 g
  - 95 % alkohol ---- 100 mL
- K₂SO₄-lösning K₂SO₄ ---- 4 g
  - Aq dest ---- 100 g
Brukslösningar
- Nachtblaulösning, bruks
- Aq dest ---- 405 mL
- K₂SO₄ -lösning ---- 4,5 mL
- Nachtblaulösning ---- 45 mL

Nachtblaulösning måste efter hopblandningen upphettas till 75 º-80 ºC innan den används.

Fuchsinlösning
- Fuchsin ---- 1 g
- (för kontrastfärgning) 70 % alkohol ---- 1000 mL

PANTA

- Polymyxin B ---- 50 enheter/mL
- Amfotericin ---- 5 mg/L
- Nalixidinsyra ---- 20 mg/L
- Trimetoprim ---- 5 mg/L
- Azlocillin ---- 10 mg/L

Färdig lösning kan köpas från Becton Dickinson.