Bilaga 6 Mykobakterier; substrat-och reagensrecept

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
Den utskrivbara versionen stöds inte längre och kanske innehåller renderingsfel. Uppdatera din webbläsares bokmärken och använd standardutskriftsfunktionen istället.

Sekundärartikel till Tuberkulos-laboratoriediagnostik

Mykobakterier; substrat- och reagensrecept

Löwenstein-Jensen medium

(OBS! 3 tillverkningsdagar)

  • Dag 1
    • 1. Lutlösning, saltlösning och malakitgröntlösning prepareras (se nedan).
  • Dag 2
    • 1. Ägg (32 st per hel sats) placeras i hinkar.
    • 2. Lutlösningen hälls över äggen (glasögon och handskar).
    • 3. Efter 3 timmar hälls lutlösningen av, varefter äggen sköljs med rinnande vatten i 4 timmar.
    • 4. Vattnet hälls av och äggen får stå i kyl 4 ºC över natten.
  • Dag 3
    • 1. Äggen tas upp med sterila handskar och slås upp, ett i taget, i en steril bägare. Kontrollera att inget är skämt. Äggen vispas ihop med en steril visp. 1340 mL ägglösning hälls ned i en steril 5 L E-kolv och skakas i skakmaskin 10 minuter.
    • 2. En sats saltlösning och 26 mL malakitgröntlösning tillsätts.
    • 3. Skakas i skakmaskin 10 minuter. Blandningen filtreras genom gasväv (steril) och får vila i 20-30 minuter.
    • 4. Dispenseras i sterila odlingsrör.
    • 5. Mediet koaguleras i värmeskåp 80-85 ºC 1 timme.


  • Lutlösning:
    • Till 2 hinkar med 8-10 L vatten tillsätt
      • ≈ 100 mL lutpastiller NaOH, som får lösa sig till följande dag.

OBS! Glasögon och handskar måste användas vid hanteringen av lutlösningen.

  • Saltlösning
    • Kalium-di-vätefosfat KH2PO4 ---- 3,2 g
    • Magnesiumfosfat MgSO4x7H2O ---- 0,32 g
    • Tri-Magnesium-dicitrat C12H10Mg3O14x14 H2O ---- 0,8 g
    • L-Aspargin ---- 4,8 g
    • Glycerol ---- 16,0 mL
    • 1 M HCl ---- 50,0 mL
    • Avjoniserat vatten ---- 700,0 mL
  • 1. Saltlösningen vägs upp i 1500 mL E-kolv.
  • 2. Värms till nästan kokpunkt.
  • 3. 40 g potatisstärkelse löses i 100 mL avjoniserat vatten.
  • 4. Stärkelselösningen tillsätts under omskakning.
  • 5. Autoklaveras i 20 minuter, 120 ºC.
  • 6. Efter autoklavering förvaras kolvarna i rumstemperatur.


  • Malakitgrönt 2 % lösning
    • Malakitgrönt-oxalat ---- 3,0 g
    • Avjoniserat vatten ---- 150 mL
  • 1. Malakitgrönt-oxalat vägs upp i 300 mL glasflaska.
  • 2. Avjoniserat vatten tillsätts.
  • 3. Flaskan placeras i vattenbad med kokande vatten.
  • 4. Flaskan skakas då och då tills pulvret gått i lösning.

Reagens för dekontaminering av prov

  • NALC och NaOH
    • A. 4% NaOH ----- 500 mL
    • B. 2.9 % natriumcitrat dihydrat eller 2.6 % vattenfri natriumcitrat ----- 500 mL
    • C. NALC (tillverka dagligen) ----- 5 g
    • D. pH 6,8 fosfatbuffert (eller sterilt destillerat vatten)

Blanda A och B, sterilisera och förvara för användning senare. Tillsätt reagens C strax innan användning. Förbrukas inom 24 timmar.


  • Natriumlaurylsulfatlösning
    • Natrium laurylsulfat 99,9 % ---- 45 g
    • Avjoniserat vatten ---- 1500 mL
    • Natriumhydroxid, NaOH ---- 15 g

Laurylsulfatet löses i ca 60 ºC vatten, NaOH tillsätts innan utfällningen börjar. Använd mycket rena kärl. Fylls med ca 750 mL på 1 liters flaskor och autoklaveras i 120 ºC i 20 min. Ställs i 37 ºC termostat snarast.


  • Neutralisationslösning för dekontaminering
    • Svavelsyra H2SO4 konc. (98 %)---- 0,9 mL
    • Avjoniserat vatten ---- 1000 mL
    • Bromkresolpurpur 1 % ---- 0,8 mL

Blandas, fylles med ca 1000 mL på 1 liters flaskor. Autoklaveras 120 ºC i 20 minuter.

Reagens för fluorescensmikroskopi

  • Auramin
    • Auramin ---- 3,0 g
    • Fenol ---- 32 mL
    • H2O ---- 968 mL


  • Syra-alkohol lösning.
    • 3,0 mL koncentrerad HCl adderas långsamt till 97,0 mL 90-95 % etanol (stark värme kan utvecklas).


Reagens för Hallbergfärgning

  • Stamlösningar
    • Nachtblaulösning
    • Nachtblau ---- 5 g
      • 95 % alkohol ---- 100 mL
    • K2SO4-lösning K2SO4 ---- 4 g
      • Aq dest ---- 100 g
  • Brukslösningar
    • Nachtblaulösning, bruks
    • Aq dest ---- 405 mL
    • K2SO4 -lösning ---- 4,5 mL
    • Nachtblaulösning ---- 45 mL

Nachtblaulösning måste efter hopblandningen upphettas till 75 º-80 ºC innan den används.

  • Fuchsinlösning
    • Fuchsin ---- 1 g
    • (för kontrastfärgning) 70 % alkohol ---- 1000 mL


  • PANTA
    • Polymyxin B ---- 50 enheter/mL
    • Amfotericin ---- 5 mg/L
    • Nalixidinsyra ---- 20 mg/L
    • Trimetoprim ---- 5 mg/L
    • Azlocillin ---- 10 mg/L


Färdig lösning kan köpas från Becton Dickinson.

Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=Bilaga_6_Mykobakterier;_substrat-och_reagensrecept&oldid=6029"