Bordetella pertussis
Huvudartikel
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Nedre luftvägsinfektioner, 2:a upplagan 2005
Bordetella pertussis och parapertussis
Smittämnen
Bordetella pertussis är en liten, aerob, gramnegativ stav som orsakar kikhosta. Bakterien beskrevs första gången av Bordet och Gengou 1906. Den har ingen känd djurreservoar och framkallar sjukdom endast hos människa. Förutom Bordetella pertussis hänförs till genus Bordetella de närbesläktade B. parapertussis, som även förekommer hos får, och B. bronchiseptica som orsakar infektion hos bl.a. gris, hund, kanin och marsvin samt B. avium, B. holmesii, B. hinzii och B. trematum, vilka sällan ses vid infektion hos människa.
Patogenes och patofysiologi
Bakterien fäster sig i en första fas vid cilierna på det respiratoriska epitelet, bl.a. med hjälp av olika adhesiners specifika bindning till glykoproteiner. I nästa fas utsöndras toxiner. Pertussis toxin (PT) bildas endast av B. pertussis. Det fungerar både som adhesin och toxin. Det anses vara ett s.k. superantigen d.v.s. extremt aktivt i att stimulera vissa T-celler i celldelningen, vilket återspeglas i en lymfocytos. Andra pertussiskomponenter av adhesintyp som antas medverka i bakteriens angrepps¬mekanism är filamentöst hemagglutinin (FHA), pertaktin och fimbrier. Olika kombinationer av dessa virulensfaktorer ingår i nya s.k. acellulära vacciner. Andra toxiner bidrar till sjukdomen genom att inducera paralys av luftvägsepitelets cilier och ge lokal nekros.
Bakterien invaderar ej underliggade vävnad. Den tycks dock kunna överleva intracellulärt i makrofager och därigenom undandras effekten av cirkulerande antikroppar. T-cellsimmunitet utgör en viktig del av infektionsskyddet och AIDS-patienter har en tendens att få besvärande kikhosta.
Symtom och klinisk bild
Kikhostans sjukdomsbild kan variera från en symtomfri infektion till klassisk kikhosta med kikningar och kräkningar. Efter en inkubationstid på vanligen 5-7 dagar debuterar sjukdomen med ospecifika, katarrala symtom som varar ca 7 dagar för att sedan i typiska fall övergå i en paroxysmal fas. Denna period pågår i klassiska fall från 2-3 veckor till flera månader. Vaccination och tidig antibiotikabehandling modifierar symtomen.
För kikhosta typiska symtom kan också orsakas av Bordetella parapertussis, Mycoplasma pneumoniae, adenovirus m.fl. agens. Till skillnad från B. pertussis ger mykoplasma feber och förändringar på lungröntgen. I en svensk vaccinstudie omfattande ca 5 000 hostepisoder kunde pertussisinfektion påvisas endast i ca 25 %.
Provtagning och transport
Önskemål om pertussisodling måste särskilt anges på remissen.
Provtagning från nasofarynx är standard. Odling från aspirat ger bättre utbyte än odling från pinne eftersom en viss del av bakteriepopulationen fastnar på pinnen. Aspirationstekniken har med framgång använts vid vaccinstudier på barn (Hallander, 1993). Pinnprov torde dock vara ett enklare förfarande på vuxna och i vanlig praxis. Nasofarynxpinne Copan CP 184 c rekommenderas. Alginat på aluminumskaft hämmar PCR. Alginat har också en tendens att lösas upp i transportsubstratet. Bomull kan innehålla fettsyror som är toxiska för bakterien. Se vidare provtagningsanvisningar under resp. provtyp.
Transporten är kritisk. Bäst resultat erhålls vid odling i direkt anslutning till provtagningen. När sådana arrangemang inte är möjliga är transport i medium beskrivet av Regan och Lowe (se Bilaga 1 Bakteriologiska substratrecept-NLI) optimalt eftersom detta vid ankomsten till laboratoriet också kan inkuberas för anrikning. Vanliga transportsubstrat är också användbara men ger sämre utbyte.
Upprepad odling ger alltid ett ökat utbyte; i en svensk vaccinstudie med så mycket som 12 %.
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Diagnostiken baseras dels på direktpåvisning av organismen dels på serologi. I en svensk vaccinstudie omfattande 1072 kikhostefall verifierades 53 % genom odling och 45 % med serologi. Odlingsnegativa och serologinegativa men PCR-positiva utgjorde endast ett par procent. Vid modifierad sjukdom ökar andelen serologiskt diagnostiserade fall. Obehandlade är cirka hälften odlingspositiva 3 veckor efter symtomdebuten. En vecka senare är cirka en fjärdedel fortfarande positiva.
Referensmetod för påvisande av kikhostebakterier är odling från nasofarynx på särskilda selektiva medier. Tillsammans med serologi utgör odling referensmetodik för påvisande av pertussisinfektion.
Referensmetodik
a) Odling: Pertussisbakterien är för sin växt beroende av vissa aminosyror, framförallt cystein och glutaminsyra. Organismen fermenterar ej kolhydrater och är strikt aerob. Det traditionella Bordet-Gengou mediet som innehåller potatisstärkelse, glycerol och 10-15 % fårblod har idag ersatts av medier med längre hållbarhet.
Referenssubstrat är charcoal agarbas enligt Regan och Lowe (Bilaga 1 Bakteriologiska substratrecept-NLI) med tillsats av 10 % hästblod och cefalexin till en koncentration av 40 mg/L.
Isolering
Odlingsplattorna inkuberas vid 35-37 C i vanlig atmosfär och i plastplåsar för att motverka uttorkning. Avläsning sker regelbundet under 7 dagar.
Det finns rapporterat att utbytet ökar med 16 % vid odling i 12 dagar och att CO2-miljö kan hämma utbytet (McGowan 2002). Anrikning kan öka utbytet med 7-14 %. För anrikning används samma substrat som till odling men med halva agarmängden. Subkultur från anrikningsröret till pertussisplattor utförs efter 48-72 tim i 35-37 C.
Identifiering och minimikriterier
Misstänkta kolonier kan vanligen iakttas efter 3 dagar. Kolonierna är grå, skinande och konvexa. De har beskrivits som kvicksilverdroppar. B. pertussis är till skillnad från B. parapertussis oxidaspositiv. Den senare växer också på blodagar. Haemophilus influenzae som också är en oxidaspositiv bakterie med särskilda tillväxtkrav skall uteslutas.
Verifiering sker vid odling genom objektglasagglutination med specifika sera för B. pertussis och B. parapertussis. Vissa stammar ger svag agglutination särskilt i utspätt serum. I tveksamma fall sker slutlig verifiering med PCR.
Alternativa diagnostiska metoder för påvisande
Direkt-FA : Vid vissa laboratorier används direktmikroskopi med fluorescerande antikroppar. I vana händer och med goda reagens är detta en specifik och snabb metod. Den är dock väsentligt okänsligare än odling. Vid en genomgång av 1 582 konsekutiva pertussisodlingar i Uppsala 1996-1997 var 18 % positiva (n=281) men endast 38 % (n=108) också positiva i direkt-FA. Specificiteten var 99,6 %.
Nukleinsyrapåvisning: Någon standardmetod för PCR finns inte beskriven. Numera är också realtids-PCR under utprövning. Olika regioner av pertussis-DNA har använts som målsekvenser: 1) PT promotor region som också förekommer hos B. parapertussis och B. bronchiseptica 2) IS481 insertion sequencies som förekommer i upp till 80 kopior på bakteriekromosomen 3) en DNA-region uppströms poringenen och 4) genen för adenylat cyklas toxin som också förekommer hos B. parapertussis.
Det finns också många metoder beskrivna för provbehandling och detektering av PCR-produkten.
PCR har sammantaget emellertid visat bättre känslighet än odling även om falskt-negativa resultat, beroende på hämning av Taq-polymeras, också beskrivits i varierande omfattning. Metoden har introducerats i ökande omfattning vid landets laboratorier. År 2004 var ca 50 % av laboratorierapporterade pertussisfall baserade på PCR-resultat.
PCR kan dock ännu ej rekommenderas som referensmetod. Det vanligaste primervalet IS481 korsreagerar med B. holmesii och B. bronchiseptica. Det är ännu inte klarlagt i vilken utsträckning detta påverkar den diagnostiska specificiteten. Massachusetts State Laboratory har rapporterat växt av 3,6 % B. holmesii i prov insända för pertussisdiagnostik. Andra primerval har visat sig försämra den diagnostiska sensitiviteten väsentligt.
Svarsrutiner: Då resultatet baseras på annan metod för direktpåvisning än odling bör denna anges ev. tillsammans med reservation för avvikande prestanda.
Resistensutveckling och resistensbestämning
Isolerade pertussisbakterier är i regel känsliga för erytromycin. Resistensutveckling har dock rapporteras från USA. Resistensbestämning är ej aktuell annat än i riktade studier.
Epidemiologisk typning
Epidemiologisk typning är värdefull som underlag för bedömning av ev. skift av cirkulerande kikhostebakterier i samband med lokala utbrott eller vid byte av vaccinationspolicy. Härvid analyseras serotyp samt polyformism i generna för toxin och pertaktin. PFGE är också av värde.
Kvalitetskontroll
- Referensstammar
- Bordetella pertussis CCUG 34132,
- Bordetella pertussis CCUG 34133, agglutinerar endast i ospätt B. pert antiserum (Difco) eller efter förlängd observationstid,
- Bordetella parapertussis CCUG 33580.
Svarsrutiner: Stammar som uppfyller minimikriterierna utsvaras, Växt av Bordetella pertussis alt. Bordetella parapertussis.
b) Serologi: Den andra delen av referensmetodiken bygger på mätning av antikroppar i parade sera och är ett viktigt komplement till odling för påvisande av pertussisinfektion. Singelserumdiagnostik kan ge viss vägledning men brist på utvärderade referenspopulationer gör tolkningen osäker. Detta gäller såväl IgG som IgA antikroppar.
Referensmetod är kvantitativ bestämning i ELISA av IgG och IgA anti-PT och anti-FHA, uttryckt i arbiträra ELISA-enheter. Se vidare under bilaga 4.3.
Laboratorierapportering
Kikhosta/Bordetella pertussis är anmälningspliktig enl. smittskyddslagen, Övriga anmälningspliktiga sjukdomar.
REFERENSER
- Hallander H O, Reizenstein E, Renemar B, Rasmuson G, Mardin L and Olin P. 1993. Comparison of nasopharyngeal aspirates with swabs for culture of Bordetella pertussis. J. Clin. Microbiol. 31: 50-52.
- Hallander, H O. 1999. Microbiological and serological diagnosis of pertussis. Clinical Infectious Diseases. 28(Suppl 2):S99-106.
- McGowan K.L. 2002. Diagnostic tests for pertussis: Culture vs. DFA vs. PCR. Clin. Microbiol. Nwslett. 24:143-149.
- Mooi, F.R., H. Hallander, C.H.W von König, B. Hoet, and N. Guiso. 2000. Epidemiological typing og Bordetella pertussis isolates: recommendations for a standard methodology. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 19:174-181.