Identifiering av bakterier i rutindiagnostik
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Bakteriologisk diagnostik av infektioner i hud, mjukdelar, skelett och inre organ
och
Referensmetodik: Laboratoriemetoder
Identifiering av bakterier i rutindiagnostik
Allmänt
Korrekt identifiering av mikroorganismer i ett prov är av största betydelse för bedömningen av den kliniska och epidemiologiska relevansen samt för resistensbestämningen av fyndet. Ett flertal tekniker, med varierande tidsåtgång och kostnad, finns tillgängliga. Adekvat taxonomisk nivå för rutinmässig identifiering av mikroorganismer avgörs av flera faktorer som kliniska data, provlokal och mikroorganismens patogenicitet. Omväxlande används familj, genus, species eller gruppbeteckningsnivå, vilket framgår av texten. I rutindiagnostiken av patientprov har processtiden samt kostnaden en avgörande betydelse för val av identifieringsmetod. De observationer och tester som tillämpas syftar till att beskriva bakterien så att den kan jämföras med andra tidigare identifierade bakterier.
Den fenotypiska identifieringen baseras primärt på erfarenhet om de olika isolatens morfologiska utseende och eventuella lukt. Närmare genus/speciesbestämning sker via olika spårbara tester. För sällsynta, atypiska och speciella mikroorganismer (t.ex. de som omfattas av smittskyddslagen) krävs ofta kompletterande tester för korrekt identifiering.
I fall där närmare genus/speciesbestämning ej anses kliniskt nödvändig används gruppbeteckningar baserade på växtsätt och kriterier närmare definierade under resp. avsnitt.
För deskriptiva tolkningar av typ ”normalflora” behöver ofta inga identifieringstest utföras.
Ställningstagande till diagnostisk nivå (gällande generellt metodval och även i det enskilda fallet) bestäms av medicinskt ansvarig bakteriolog utifrån lokala erfarenheter och geografisk prevalens av olika mikroorganismer.
I förslaget till minimikriterier har arbetsgruppen valt identifieringstester som är allmänt förekommande i svensk praxis. Med minimikriterier menas de fenotypiska egenskaper som är praktiskt och taxonomiskt användbara för avsedd nivå och som är adekvata för identifiering i sitt kliniska sammanhang. De uppfyller också de krav som ställs för artrelaterad resistensbestämning. De vanligaste patogenerna samt de bakterier som i många stycken betraktas som föga patogena vid rutinodlingar beskrivs på de följande sidorna. För mer ovanliga eller svåridentifierade isolat, hänvisas till särskilt avsnitt i denna bok samt till referenslitteratur eller referenslaboratorium.
Vid validering av alternativ rutinidentifiering bör utvärderingen ske både mot här angivna tester och mot metodik som tillåter full speciesidentifiering.
Identifieringsbegrepp
Genus/speciesbestämning
Kliniskt intressanta och vanligt förekommande isolat, angivna med objektiva (t.ex. biokemiska tester) och subjektiva (t.ex. utseende och lukt) fenotypiska minimikriterier för rutindiagnostik. Ex. Staphylococcus aureus och Enterococcus species.
Gruppbeteckning
Icke taxonomiskt begrepp inom rutinbakteriologin. Beteckning för en, ibland homogen och ibland heterogen, grupp av bakterier med vissa gemensamma objektiva (t.ex. mikroskopi, biokemiska tester) och/eller subjektiva (t.ex. utseende och luktfenotypiska) egenskaper. Närmare artidentifiering anses inte nödvändig i rutindiagnostik. Ex. Koagulasnegativa stafylokocker (KNS), alfastreptokocker och difteroida stavar.
Växtsätt
I flera fall används begreppen aerob miljö, aerob bakterie, anaerob miljö etc. Begreppen syftar i första hand på olika mikroorganismers växtsätt i laboratoriemiljö i relation till syre. I aerob miljö är tillgången på syre god (>20 %) och koldioxidhalten 0,03 %. I anaerob miljö är syrehalten starkt reducerad, under 1 %, samtidigt som koldioxid och vätgas justerats till ca 10% vardera. Anaerob miljö uppnås effektivast i anaerobbox, där syrenivåer under 0,1 % kan erhållas. I klockor med kommersiella gasgenererande system uppnås god anaerobios (syrenivåer på 0,5–1 %) inom någon timme. Även i nedre delen av buljongrör där mediet innehåller små mängder agar och reducerande substanser som tioglykollat och cystein uppnås relativt god anaerobios t.o.m. i aerob miljö. I aeroba system föreligger oxiderande redoxförhållanden, vilket innebär att elektroner kan vandra till syre (elektronacceptor) som sålunda fungerar oxiderande. Man säger att aerob miljö, genom syrets egenskaper, kännetecknas av en hög redoxpotential, normalt mellan 50 – 75 mV mätt med syre-väte elektroder. I frånvaro av syre föreligger reducerande redoxförhållanden och låg redoxpotential, idealt ≤250 mV. I mikroaerofil miljö är syrehalten reducerad jämfört med aerob miljö, med syrenivå på ca 7 % och koldioxidnivå på ca 14 %.
Syntesen av makromolekyler kräver tillgång till energi. Denna frigörs i aerob oxiderande miljö under elektronvandringen i den metabola elektrontransportkedjan, aerob respiration, med syre som terminal elektronacceptor. I anaeroba system kan energi inte frigöras i en elektrontransportkedja. I sådan miljö tillgodogör sig mikroorganismerna energi genom anaerob fermentation som är en direkt enzymatisk attack på socker. Denna typ av metabolism är långt mindre effektiv än den aeroba elektrontransporten vad avser mängden frigjord energi.
Vid aerob respiration bildas skadliga reaktiva komponenter som väteperoxid, superoxid och hydroxylradikaler. Aeroba bakterier skyddar sig mot dessa med olika enzymsystem som superoxiddismutas och katalas. De flesta anaeroba bakterier saknar sådana skyddande enzymer och dör i närvaro av syre. Vissa aerotoleranta anaeroba bakterier skyddar sig med NADH-oxidas som med vätgas omvandlar syre till vatten.
Definitioner
Obligat (strikt) aerob
Växer bara vid god syretillgång med oxiderande redoxförhållanden (aerob miljö). Metabolism av typ aerob respiration, d.v.s. syre fungerar som terminal elektronacceptor. Exempel på sådana organismer är Acinetobacter, Moraxella och Pseudomonas.
Obligat (strikt) anaerob
Växer bättre i frånvaro av syre under reducerande redoxförhållanden (anaerob miljö) än i aerob miljö. Metabolism av typ anaerob fermentation. De flesta kliniskt relevanta obligat anaeroba bakterier är relativt toleranta mot syre och kan växa vid syrenivåer på någon eller t.o.m. några procent. Hit hör Bacteroides, Prevotella, Veillonella och Clostridium perfringens. Vissa arter, t.ex. Clostridium haemolyticum, vissa isolat av Prevotella melaninogenica är intoleranta även mot små restmängder syre på nivåer från 0,1 %. Propionibacterium acnes kan växa vid endast lätt reducerad syrehalt i 5-10 % koldioxid. Vissa streptokockarter som metaboliserar med anaerob fermentation kan likväl växa också i aerob miljö. Dessa kallas ”aerotoleranta anaerober”.
Fakultativt anaerob
Kan växa i aerob och anaerob miljö och växlar därvid mellan aerob respiration och anaerob fermentation. Exempel är stafylokocker, enterokocker, många streptokocker, Enterobacteriacae, Vibrio och Haemophilus.
Mikroaerofil
Växer bara i miljöer med reducerad syrehalt där de dock använder aerob respiration. Exempel är Campylobacter species.
Maldi-Tof
Se artikeln Maldi-Tof.