MLVA

Den utskrivbara versionen stöds inte längre och kanske innehåller renderingsfel. Uppdatera din webbläsares bokmärken och använd standardutskriftsfunktionen istället.

Artikel under bearbetning

Artikel publicerad april 2012. Innehållet preliminärt i väntan på konsensusförfarande

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik

Multiple locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA)

Allmänt

Den epidemiologiska typningsmetoden Multiple locus VNTR analysis (MLVA), där VNTR står för variable number tandem repeats, detekterar för respektive art som studeras utvalda områden i genomet (locus, pl loci) med repeterade sekvenser. Då antalet repetitioner varierar för olika isolat beroende på epidemiologiskt samband kan detta användas för släktskapsanalyser. Vanligt är att omkring tio primerpar används för PCR-detektion av lika många loci som i sin tur innehåller varierande antal repetitioner hos stammar med olika ursprung. Exempel på bakteriearter som kan typas epidemiologiskt med den här tekniken är Mycobacterium tuberculosis (tekniken kallas då MIRU-VNTR), Pseudomonas aeruginosa och bakterier inom familjen Enterobacteriaceae som Escherichia coli.

Vid epidemiologisk typning av Escherichia coli detekteras sju loci i bakteriegenomet med PCR. Dessa loci innehåller lika antal repetitioner för de isolat som har gemensamt ursprung men varierande antal repetitioner hos stammar med olika ursprung. PCR för sju loci kan utföras som singelreaktioner varefter resultatet analyseras på agarosgel tillsammans med storleksmarkör för att antalet repetitioner i varje locus ska kunna beräknas. I nedan beskrivna metodik används märkta primrar för PCR och flera av reaktionerna kan då utföras i samma PCR-rör, så kallad multiplex PCR. För storleksbestämning av de bildade DNA-fragmenten och för beräkning av antalet repetitioner används sekvensutrustning som kan detektera och storleksbestämma de bildade DNA-fragmenten.

Utförande av MLVA för epidemiologisk typing av Escherichia coli

De sju loci som detekteras är: CVN001; CVN002; CVN003; CVN004; CVN007; CVN014 och CVN015. Primersekvenserna för detektion anges i tabell 1 och är kombinerade i tre olika PCR-analyser. Sammansättningen av mastermixen för varje multiplex-PCR anges i tabell 2.

Templatet för varje mastermix är en kokt och hastigt centrifugerad bakteriesuspension. För amplifieringen används instrumentet GeneAmp 9700 termocycler (Applied-Biosystems). De båda multiplexreaktionerna M1 och M2 sker i 95°C i 15 min, därefter 25 cycler 94°C i 30 sek, 63°C i 90 sek och 72°C i 90 sek och programmet avslutas med 72°C i 10 min. Reaktionen M3 sker separat och inleds med 94°C i 5 min, därefter 30 cycler vid 94°C i 30 sek, 50°C i 30 sek och 72°C i 50 sek och hela programmet avslutas med 72°C i 7 min.

Efter PCR-amplifiering poolas PCR-produkterna enligt följande:

Elektrofores A. Från M1 tas 2,5 µL och från M3 tas 2 µL som blandas med med 30 µL vatten. Från denna mix tas 1 µL till 0,5 µL Genflo-625 TAMRA (CHIMERx) intern standard och 12 µL formamid för elektrofores i ABI-310 Genetic analyser (Applied Biosystems).
Elektrofores B. Från M2 tas 1 µL till 50 µL vatten som blandas med Genflo-625 TAMRA och formaid enligt ovan.

Tabell 1

Tabell 2

Analys av sekvenseringsresultatet

Varje topp identifierad av instrumentet motsvaras av ett locus. Detta storleksbestäms med hjälp av standarden. Dess storlek är avhängigt antalet repetitioner i fragmentet. Slutsvaret för varje isolat innebär en sju-siffrig nummerserie motsvarande antalet repetitioner dvs längden av vart och ett av de sju områden som amplifierats och storleksbestämts.

REFERENSER

Lindstedt B et al. Study of polymorphic variable-number of tandem repeats loci in the ECOR collection and in a set of pathogenic Escherichia coli and Shigella isolates for use in a genotyping assay J Microbiol Methods. 2007 Apr;69(1):197-205.