Maldi-Tof

Artikel publicerad maj 2012

---

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Bakteriologisk diagnostik av infektioner i hud, mjukdelar, skelett och inre organ

och

artiklarna Identifiering av bakterier i rutindiagnostik och minimikriterier

---

Taxonomi och typningsmetoder

Med taxonomi avses den systematiska indelningen av mikroorganismer som baseras på klassifikation (inbördes likhet i grupper), nomenklatur (benämning/etikettering) och identifikation (diagnostisk process där egenskaper hos den okända mikroben jämförs med för viss art/genus accepterade kriterier).

Tyngdpunkten i tidiga klassificeringssystem har förutom beskrivning av växtsätt legat på morfologiska kriterier. Genom att sedan följa ett biokemiskt testschema i en speciell ordning med dikotomiskt utfall i positivt respektive negativt resultat kan en uppdelning ske ned på artnivå. Detta ligger till grund för det vi i vanligt tal anger som minimikriterier. Med detta system når man en hög grad av specificitet.

Problem uppstår då en okänd mikroorganism inte faller ut i ett sådant schema. Genom att skapa databaser för biokemisk artidentifiering baserad på ett stort antal fenotypiska reaktioner och testat på ett mycket stort antal stammar, t.ex. API, har man småningom löst problemet att kvantifiera sannolikheten för att ett isolat tillhör en viss art/genus/grupp. Förutsättningen för korrekt diagnos är att isolatets morfologi (mikro- respektive makroskopiskt) och växtsätt är förenligt med databasens förslag.

Ytterligare ett stort steg i taxonomins utveckling togs i slutet av 1980-talet då man säkrat metoder för att fastställa art genom sekvensbestämning av hela genomet (DNA-DNA hybridisering). Denna fylogenetiska inriktning syftar till att fastställa släktskap och evolutionsmässigt avstånd mellan liknande mikroorganismer.

Eftersom det ändå kan finnas en mycket hög grad av likhet mellan olika arter vid t.ex. DNA-DNA hybridisering, har man pragmatiskt konstaterat att genotypiska och fenotypiska drag skall vägas samman (polyfasisk taxonomi).

De senaste årens snabba metodutveckling inom nukleinsyrabaserade metoder, bland annat 16 sRNA-sekvensering (PCR med sekvensering av den bakteriella genen för 16s rRNA.), och Maldi-Tof (Matrix-assisted-laser-desorption-ionisation Time-of-flight) har radikalt förändrat möjligheterna till säkrare diagnostik på artnivå. Genom att rutinmässigt använda dessa typningssystem på kliniskt mikrobiologiska laboratorier ökar också möjligheten att snabbare identifiera ovanligare agens och korrelera dessa till kliniken.

Maldi-Tof

Redan idag har säkerheten för Maldi-Tof på rena kolonier nått en nivå som medger att tekniken kan användas rutinmässigt i den vardagliga artbestämningen. Med denna nya typningsmetod som möjliggör högre grad av upplösning på artnivå än äldre system ställs nya krav på laboratoriet. Förutom test av kända typstammar, dvs. de referensstammar som laboratoriet använder, bör jämförelser av typningsutfallet med den nya metoden och rutinmetoden utföras på rutinprov, förslagsvis 400-500 prov med olika provtyper representerade. Vid diskrepans bör testning med ytterligare metod utföras som säkerställer identitet på artnivå.

För Maldi-Tof metodik är den laborerande individens färdighet vid provpreparation den enskilt viktigaste faktorn för att uppnå en hög score. De begränsningar i systemen som finns idag avseende risk för felnavigering är väl kända och redovisas av leverantörerna. Även om det är ovanligt med felidentifiering förekommer det att systemet inte anger något alternativ, sannolikt p.g.a. att liknande stammar saknas i databasen. Vid låga score-resultat kan ytterligare försök göras med Maldi-Tof efter extraktionsförfarande.

Inga signifikanta prestandaskillnader finns mellan idag tillgängliga system. Marginella diskrepanser ses för vissa bakteriegrupper beroende på databasernas utformning. I takt med att databaserna successivt utvidgas kommer ytterligare species att identifieras säkert, framför allt avseende anaeroba bakterier och ovanliga mikroorganismer.

Vid validering av resultatet ingår att den föreslagna utsagan är förenlig med provtyp och basala observationer, dvs. växtsätt, koloniutseende och ev. lukt. Vid osäkerhet kontrolleras i första hand morfologin med gramfärgat preparat och ev. katalas- resp. oxidastest.

Nedan redovisas de idag kända begränsningarna med Maldi-Tof. Då det anges kan identifieras till artnivå, fungerar väl förutsätts att Maldi-Tof-algoritmen har uppnått score-kriterier för sannolik art.

Enterokocker och streptokocker

• Enterokocker kan identifieras till artnivå
• Betahämolyserande streptokocker tillhörande Lancefield-grupper A, B, C och G kan identifieras till artnivå. Beroende på laboratoriets svarsrutin kan agglutination vara aktuell för Grupp C och G.
• Pneumokocker benämns oftast korrekt men måste kontrolleras med fenotypiska test (se nedan)
• S.mitis-gruppen anges ofta felaktigt som pneumokocker.
• Artdiagnostik inom Streptococcus anginosus-gruppen är möjlig för S. anginosus och S. constellatus, dock ej för Streptococcus intermedius.
• Övriga alfastreptokocker kan typas på gruppnivå. För artnivå krävs sekvensanalys (t.ex. sodA). Speciellt viktigt inom S.bovis-gruppen (Grupp D) för isolat från blododling p.g.a. olika species’ association till koloncancer, gallvägs- och pankreascancer samt kolangit.

Stafylokocker

• De kliniskt viktigaste arterna S.aureus, S.epidermidis, S.lugdunensis, S.hominis, S. haemolyticus och S.simulans identifieras med hög säkerhet till art liksom S.saprophyticus, den senare dock med något lägre score-värden.
• För S.intermedius/pseudintermedius och S.pettenkoferi saknas obunden publicerad information.

Gramnegativa kocker

• N.gonorrhoeae och N.meningitidis kan typas till art nivå.
• För övriga Neisseriaceae spp är Maldi-Tof ännu inte optimalt.
• Moraxella catarrhalis kan typas till artnivå

Aeroba grampositiva stavar

• Artbestämning av Corynebacterium spp., inkl. C.diphtheriae fungerar väl. Detsamma gäller för Listeria, Rhodococcus, Arcanobacterium och Nocardia spp.
• Oberoende redovisningar för artbestämning av Bacillus spp. saknas.

Enterobacteriaceae

• Genus- och speciesbestämning fungerar för Enterobacteriaceae med få undantag inom släktena Serratia, Raoultella, Serratia och Citrobacter.
• Den viktigaste begränsningen är att Shigella inte kan skiljas från E.coli. Biokemisk verifikation och agglutination måste utföras på Shigella- misstänkta isolat.
• Salmonella: Inga problem att nå genusnivå. Maldi-Tof tekniken har potential att klara bestämning av såväl Salmonella species som subspecies. Till och med finns det goda möjligheter att screena för epidemiologiskt frekventa serovarer. De kommersiellt tillgängliga databaserna är dock inte utbyggda för detta.
• För Salmonella och Yersinia bör agglutination göras.
• Vid invasiv sjukdom med växt av Salmonella, exempelvis i blododling bör dessutom biokemisk analys utföras. Salmonella Typhi och Salmonella Paratyphi kan sannolikt identifieras med Maldi-Tof, dock saknas större material med obunden publicerad information.

Nonfermentativa gramnegativa stavar och HACEK-gruppen

• Goda möjligheter till korrekt genus identifikation inom hela gruppen. Viss osäkerhet finns för Stenotrophomonas (kan bero på taxonomisk oklarhet visavi vissa Pseudomonas sp.).
• Inom genus Pseudomonas, Aeromonas, Haemophilus, Pasteurella, Campylobacter, Vibrio, Legionella, Francisella och Bartonella erhålls species nivå i flertalet fall och med ett fåtal felidentifieringar.
• Inom Acinetobacter erhålls speciesnivå med hög säkerhet för A. baumanii, A. lwoffi, A. ursingii, A. radioresistens och Ac. Gen. Sp.3, dock saknas Ac. gen.sp. 13 TU i databasen.
• HACEK-gruppen (Haemophilus parainfluenzae, Aggregatibacter aphrophilus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens och Kingella kingae) kan identifieras på genusnivå och i flertalet fall på artnivå efter extraktion.
• Maldi-Tof tycks kunna erbjuda god hjälp för typning inom Burkholderia-komplexet och andra mikroorganismer hos CF-patienter men ytterligare studier krävs.

Anaeroba bakterier

• Identifiering på genusnivå fungerar väl.
• För Bacteroides, Prevotella och Clostridium sp. samt anaeroba grampositiva kocker fungerar Maldi-Tof i regel för artbestämning.
• På artnivå saknas delvis databasunderlag för Fusobacterium, Actinomyces och vissa Propionibacterium sp.

Klass 3-organismer

För dessa organismer finns sparsamt med publicerad information avseende Maldi-Tof prestanda.

                                                                                                         Leverantören anger råd för inaktivering och preparation, dock ej specifikt för dessa organismer. Det finns obunden utvärdering publicerad men konsensus saknas kring detta. I nedanstående tabell framgår vilka agens som finns representerade (15 maj, 2012) i respektive databas. 
 

AGENS	MaldiBiotyper DB och SR Database-20$^{1}$ (Bruker)	VITEK MS-ID V2 (bioMerieux)
Bacillus anthricis	ja	nej
Brucella sp	ja	nej
Burkholdieria mallei och pseudomallei	ja	nej
Francisella tularensis	ja	nej
Salmonella Typhi	ja	ja
Shigella dysenteriae	ja	nej
Yersinia pestis	ja	ja

$^{1}$Speciell riskdatabas