Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik
Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)
NASBA är en av amplifieringsmetoderna som är baserade på transkription (figur 17). Andra transkriptionsbaserade amplifieringssystem är bland annat Transcription Mediated Amplification (TMA), Transcription-based amplification system (TAS) och Self-sustained sequence replication (3SR). Kommersiella metoder baserade på denna process används för detektion av Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae och Mycobacterium tuberculosis Gen-probe samt för detektion av onkoprotein E6/E7 mRNA-uttryck från högrisk HPV Norchip. Templatet är vanligtvis RNA och metoden baseras på kopiering av RNA-målsekvensen med hjälp av tre olika enzymer; reverse transkriptas, RNaseH och T7 DNA-beroende RNA-polymeras. Metoden är isotermal, mycket snabb och ger mycket stora kopietal av målsekvensen. Mål-RNA kopieras först med enzymet reverse transkriptas till en DNA-molekyl som då bildar en RNA:DNA-hybrid. Enzymet RNaseH bryter ned RNA i denna hybrid som då innehåller endast cDNA. Många RNA-kopior kan då produceras, transkriberas, av enzymet T7 DNA-beroende RNA-polymeras från detta cDNA. Målsekvensen detekteras med en probe inmärkt med en fluorofor och en släckare/quencher, en molecular beacon probe (se Realtids-PCR). Ökningen av fluorescens i provet detekteras i en fluorescensläsare och analyseras. Risken för kontamination är mindre med system baserade på RNA-kopiering än DNA-kopiering, då RNA kopiorna som produceras inte är lika stabila som amplifierat DNA.
Figur 17. NASBA reaktionen. Bild; Technology Real Time NASBA, Copyright NorChip, [1]
