Odling och nukleinsyrapåvisning vid misstanke om riskklass 3-bakterier i prov

Artikel under utarbetande april 2012. Innehåll preliminärt ej godkänt genom konsensusförfarande

---

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar

---

Odling och nukleinsyrapåvisning vid misstanke om riskklass 3-bakterier i prov

Riskklass 3-bakterier, i första hand Mycobacterium tuberculosis, kan diagnosticeras i särskilt utrustade laboratorier. I Sverige finns sådana tillgängliga vid Smittskyddsinstitutet (SMI), universitstetssjukhusen och ett fåtal övriga länslasarett. Dessa laboratorieenheter har särskilt tillstånd för diagnostik med exempelvis odling och påvisande av nukleinsyra för någon eller några av organismerna. Rutinerna och vilka organismer som hanteras varierar mellan laboratorierna.

Nedan följer en beskrivning över den diagnostik av riskklass 3-bakterier (utom Mycobacterium tuberculosis där diagnostiken i landet beskrivs i separata artiklar) som erbjuds på SMI.

Bakgrund

Inom ramen för ett samarbete mellan SMI, SVA, FOI och Livsmedelsverket lades år 2007 grunden för nätverket Forum för beredskapsdiagnostik (FBD). Det långsiktiga målet med nätverket är att skapa och förbättra förutsättningar för ett effektivt utnyttjande av landets kapacitet och kompetens för kvalitetssäkrad och uthållig diagnostik av riskgrupp 3-agens i första hand vid utbrottssituationer, men också vid frågeställningar rörande enskilda sjukdomsfall. Detta nås med utvecklandet av harmoniserade och kvalitetssäkrade myndighetsgemensamma detektionsmetoder enligt särskild lista som grundar sig på nationella och internationella risk- och sårbarhetsanalyser. Fram till 2011 har man bland annat gemensamt utvärderat av automatiserad utrustning för extraktion av DNA i BSL3-laboratorium och utvecklat molekylärbiologisk diagnostik av Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei och pseudomallei och Coxiella. Man har även harmoniserat odlingsmetodik för ovannämnda agens.

SMI utför i dag diagnostik på säkerhetslaboratoriet med realtids PCR av dessa bakterier och Brucella species i humana prov . Arbete pågår med att utöka den diagnostiska verksamheten inom ramen för samarbetet.

Indikation

Diagnostik i säkerhetslaboratoriet vid SMI av riskgrupp 3-bakterier (Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei och pseudomallei, Brucella species och Coxiella).

Kliniska prover med sådana frågeställningar bör skickas till SMI för hantering (blod, benmärg, sårsekret, annat). I de fall det rör sig om blododlingar (ofta Brucella eller Francisella) kan de inkuberas på det lokala laboratoriet, och, utan att den först öppnas, skickas till SMI om indikation på växt föreligger. Det förekommer inte sällan att riskgrupp 3-bakterier inte primärt misstänkts, varvid positiva blododlingar redan hanterats på laboratoriet för framställning av grampreparat, utodling på agarplattor etcetera. Så snart misstanke då uppstår skall positiva flaskor och utväxta plattor skickas till SMI för diagnostik. Se också artikel Omhändertagande av kliniska prov samt framodlade mikroorganismer med särskild hänsyn till förekomst av riskklass 3 och 4 patogener.

Diagnostik av riskgrupp 3-bakterier kan även utföras vid SMI vid misstanke om avsiktlig spridning av smittämne (exempelvis vid bioterrorism).

Provmaterial

Blod eller benmärg i aerob blododlingsflaska. Koagulerad benmärg eller blod är inte lämpliga för diagnostik, eftersom de måste mortlas före hantering med risk för kontamination. De kan ändå mottas. Andra typer av prov är aspirat från abscess, lymfkörtel eller pinnprov. Tätt tejpade, förpackade i plastpåsar kan agarplattor med utväxta kolonier skickas. Det senare bör om möjligt undvikas, men det är bättre att skicka plattan så än att sticka om.

Provtransport

Enligt gällande transportföreskrifter, se Packa Provet Rätt.

Provhantering på SMI

All provhantering sker i säkerhetslaboratoriet. Observera att endast efterfrågad organism primärt diagnosticeras. Enligt önskemål från avsändare kan ytterligare diagnostik utföras (direkt-PCR på annan P3-organism, artbestämning med sekvensering av 16s rDNA, i begränsad omfattning fenotypisk diagnostik av stafylokocker). Den diagnostiska kapaciteten har nu utvidgats till att omfatta även Maldi-Tof masspektrometri.

Blododlingsflaska

• Vid ankomst: Några droppar av innehållet appliceras och sprids på blodagar och hematinagar. Plattorna inkuberas i 36+-1 °C i luft eller CO₂ och avläses efter 1, 2, 3 och 7 dagar beroende på vilket/vilka agens som efterfrågas.

Realtids-PCR från flaskinnehåll görs direkt vid ankomsten enligt särskild rutin mot efterfrågad organism.

Preliminärt provsvar (telefonsvar) lämnas till avsändare om provet blir positivt i direkt realtids-PCR.

Om direkt realtids-PCR blir negativ görs om avsändaren så önskar på samma templat direkt realtids-PCR för annan P3-organism eller artbestämning genom sekvensering av 16s rDNA.

• Blododlingsflaskan inkuberas upp till 4 veckor (gäller Brucella) i 36+-1 °C varefter realtids-PCR körs från flaskan om diagnos inte tidigare ställts.

Provet slutsvaras därefter.

Flytande prover (CSF, aspirat, och dylikt)

• Vid ankomst: Om möjligt odlas provet på blodagar och hematinagar.

Direkt realtids-PCR enligt rutiner för blododlingsflaska.

• Hanteras och slutsvaras vidare som ovan för blododlingsflaska.

Pinnprover

• Vid ankomst: Provet odlas på blodagar och hematinagar. Övrig hantering enligt nedan under Kolonier på agarplatta.

Kolonier på agarplatta

• Vid växt av blandkultur görs omstrykning på blodagar och hematinagar.
• Vid växt av renkultur görs gramfärgning och direkt realtids-PCR med ledning av primärt fynd.

Prover som mortlas (körtlar, benmärg, koagulerat blod)

• Vid ankomst: Vid behov sönderdelas provet med skalpell före mortling och mortlas i lämplig mängd PBS. Det mortlade materialet utodlas på blodagar och hematinagar och direkt realtids-PCR, varefter resterande material tillsätts en aerob blododlingsflaska.

Svarsrutiner

Preliminärsvar från PCR-analys direkt från exempelvis blododlingsflaska svaras normalt sett ut inom ett par timmar efter att provet mottagits vid SMI. Om ingen växt noterats under observationstiden besvaras provet: Ingen växt av efterfrågad organism. Om växt besvaras provet med växt av efterfrågad organism samt resultat av direkt realtids-PCR, eventuell resistensbestämning om det är begärt.

Addendum (Realtids-PCR-påvisning av P3-bakterier)

SMI:s realtids PCR mot P3-organismerna utförs på DNA som extraheras enligt särskilda rutiner på säkerhetslaboratoriet.

Med PCR-teknik amplifieras specifika nukleinsyrafragment (DNA-fragment) i närvaro av en fluorescerande TaqMan-probe som är specifik för respektive målsekvens. Extraherat templat i det okända provet identifieras genom påvisande av PCR-produkten i form av ett ct-värde. Inför PCR-analysen extraheras DNA från de kliniska provmaterialen. Sälherpes (PhHV-1) tillsätts varje patientprov (spikning), som extraktions-och inhibitionskontroll. För varje PCR körs alltid en positiv och en negativ kontroll.

• Brucella identifieras genom påvisande av en genusspecifik insertionssekvens IS711 som förekommer i varierande antal, men alltid i samma antal inom varje species. Den på SMI använda PCR-metoden påvisar Brucella till genusnivå. Diagnostiken kompletteras med samtidig identifiering av B. abortus med påvisande av BruAB2_0168 och 16S rDNA (den senare för rutinpåvisande av bakteriellt DNA).
• Francisella tularensis påvisas med amplifiering av insertionssekvensen ISFtu2. Målsekvenser som tillåter särskiljandet av typ A och B används också (Ftt0524 kodar för ett speciesspecifikt protein med okänd funktion. F. tularensis typ B kan specifikt påvisas med amplifiering av junction ISFtu2-3´reg). Genusspecifika tul4 är en gen som kodar för yttre membranproteiner.
• Bacillus anthracis påvisas med amplifiering av en för organismen specifik beta-subenhet på RNA-polymerasgenen (rpoB), tillsammans med en kromosomal markör (BA5345) och de två virulensplasmiderna pX01-pag A (svarar bland annat för toxinproduktion) och pX02-capD (kapselprotein). För diagnosen krävs att båda virulensplasmiderna påvisas. Bakterierna attenueras om en av plasmiderna saknas.
• Yersinia pestis påvisas genom amplifiering av pPCP1-PLA och den för arten specifika pMT1-caf1 som uttrycks i två virulensplasmider med endast delvis klarlagda funktioner. Inv-genen är praktiskt taget identisk med motsvarande gen hos Y. pseudotuberculosis. YPO1091 kodar för ett profagprotein hos Y. pestis.
• Burkholderia mallei och pseudomallei påvisas genom amplifiering av en genusspecifik region inom FliC-genen som kodar för flagellin. En för B. mallei specifik genregion FliP-IS407A och en för B. pseudomallei specifik gen för ett metalloproteas (mprA) amplifieras för att skilja de två arterna.
• Coxiella burnetii påvisas genom amplifiering av artspecifik insertionssekvens IS1111a.

Uppgifter om primer-och probesekvenser kan på särskild begäran tillhandahållas av SMI.