Odling och nukleinsyrapåvisning vid misstanke om riskklass 3-bakterier i prov
Artikel under utarbetande april 2012. Innehåll preliminärt ej godkänt genom konsensusförfarande
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar
Odling och nukleinsyrapåvisning vid misstanke om riskklass 3-bakterier i prov
Riskklass 3-bakterier, i första hand Mycobacterium tuberculosis, kan diagnosticeras i särskilt utrustade laboratorier. I Sverige finns sådana tillgängliga vid Smittskyddsinstitutet (SMI), universitstetssjukhusen och ett fåtal övriga länslasarett. Dessa laboratorieenheter har särskilt tillstånd för diagnostik med exempelvis odling och påvisande av nukleinsyra för någon eller några av organismerna. Rutinerna och vilka organismer som hanteras varierar mellan laboratorierna.
Nedan följer en beskrivning över den diagnostik av riskklass 3-bakterier (utom Mycobacterium tuberculosis där diagnostiken i landet beskrivs i separata artiklar) som erbjuds på SMI.
Bakgrund
Inom ramen för ett samarbete mellan SMI, SVA, FOI och Livsmedelsverket lades år 2007 grunden för nätverket Forum för beredskapsdiagnostik (FBD). Det långsiktiga målet med nätverket är att skapa och förbättra förutsättningar för ett effektivt utnyttjande av landets kapacitet och kompetens för kvalitetssäkrad och uthållig diagnostik av riskgrupp 3-agens i första hand vid utbrottssituationer, men också vid frågeställningar rörande enskilda sjukdomsfall. Detta nås med utvecklandet av harmoniserade och kvalitetssäkrade myndighetsgemensamma detektionsmetoder enligt särskild lista som grundar sig på nationella och internationella risk- och sårbarhetsanalyser. Fram till 2011 har man bland annat gemensamt utvärderat av automatiserad utrustning för extraktion av DNA i BSL3-laboratorium och utvecklat molekylärbiologisk diagnostik av Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei och pseudomallei och Coxiella.
SMI utför i dag diagnostik på säkerhetslaboratoriet med realtids PCR av dessa bakterier och Brucella species i humana prov . Arbete pågår med att utöka den diagnostiska verksamheten inom ramen för samarbetet.
Indikation
Diagnostik i säkerhetslaboratoriet vid SMI av riskgrupp 3-bakterier (Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei och pseudomallei, Brucella species och Coxiella).
Kliniska prover med sådana frågeställningar bör skickas till SMI för hantering (blod, benmärg, sårsekret, annat). I de fall det rör sig om blododlingar (ofta Brucella eller Francisella) kan de inkuberas på det lokala laboratoriet, och, utan att den först öppnas, skickas till SMI om indikation på växt föreligger. Det förekommer inte sällan att riskgrupp 3-bakterier inte primärt misstänkts, varvid positiva blododlingar redan hanterats på laboratoriet för framställning av grampreparat, utodling på agarplattor etcetera. Så snart misstanke då uppstår skall positiva flaskor och utväxta plattor skickas till SMI för diagnostik. Se också artikel Omhändertagande av kliniska prov samt framodlade mikroorganismer med särskild hänsyn till förekomst av riskklass 3 och 4 patogener.
Diagnostik av riskgrupp 3-bakterier kan även utföras vid SMI vid misstanke om avsiktlig spridning av smittämne (exempelvis vid bioterrorism).
Provmaterial
Blod eller benmärg i aerob blododlingsflaska. Koagulerad benmärg eller blod är inte lämpliga för diagnostik, eftersom de måste mortlas före hantering med risk för kontamination. De kan ändå mottas. Andra typer av prov är aspirat från abscess, lymfkörtel eller pinnprov. Agarplattor med utväxta kolonier.
Provtransport
Enligt gällande transportföreskrifter, se Packa Provet Rätt.
Provhantering på SMI
All provhantering sker i säkerhetslaboratoriet. Observera att endast efterfrågad organism primärt diagnosticeras. Enligt önskemål från avsändare kan ytterligare diagnostik utföras (direkt-PCR på annan P3-organism, artbestämning med sevensering av 16s rDNA, i begränsad omfattning fenotypisk diagnostik av stafylokocker). Den diagnostiska kapaciteten har nu utvidgats till att omfatta även MALDI-TOF masspektrometri.
Blododlingsflaska
- Vid ankomst: Några droppar av innehållet appliceras och sprids på blodagar och hematinagar. Plattorna inkuberas anaerobt i 36 °C och avläses efter 1, 2 och 3 dagar.
Realtids-PCR från flaskinnehåll görs direkt vid ankomsten enligt särskild rutin mot efterfrågad organism.
Preliminärt provsvar (telefonsvar) lämnas till avsändare om provet blir positivt i direkt realtids-PCR.
Om direkt realtids-PCR blir negativ görs om avsändaren så önskar på samma templat direkt realtids-PCR för annan P3-organism eller artbestämning genom sekvensering av 16s rDNA.
- Blododlingsflaskan inkuberas 4 veckor varefter realtids-PCR körs från flaskan om diagnos inte tidigare ställts.
Provet slutsvaras därefter.
Flytande prover (CSF, aspirat, och dylikt)
- Vid ankomst: Om möjligt odlas provet på blodagar och hematinagar.
Direkt realtids-PCR enligt rutiner för blododlingsflaska.
- Hanteras och slutsvaras vidare som ovan för blododlingsflaska.
Pinnprover
- Vid ankomst: Om möjligt odlas provet på blodagar och hematinagar. Övrig hantering enligt nedan under Kolonier på agarplatta.
Kolonier på agarplatta
- Vid växt av blandkultur görs omstrykning på blodagar och hematinagar.
- Vid växt av renkultur görs gramfärgning och direkt realtids-PCR med ledning av primärt fynd.
Prover som mortlas (körtlar, benmärg, koagulerat blod)
- Vid ankomst: Vid behov sönderdelas provet med skalpell före mortling och mortlas i lämplig mängd PBS. Det mortlade materialet utodlas på blodagar och hematinagar och direkt realtids-PCR, varefter resterande material tillsätts en aerob blododlingsflaska.
Svarsrutiner
Preliminärsvar från PCR-analys direkt från exempelvis blododlingsflaska svaras normalt sett ut inom ett par timmar efter att provet mottagits vid SMI. Om ingen växt noterats under observationstiden besvaras provet: Ingen växt av efterfrågad organism. Om växt besvaras provet med växt av efterfrågad organism samt resultat av direkt realtids-PCR, eventuell resistensbestämning om det är begärt.
Addendum
(Textutformning pågår)
SMI:s realtids PCR mot P3-organismerna utförs på extraherat DNA som prepareras enligt särskilda rutiner på säkerhetslaboratoriet.
Med PCR-teknik amplifieras specifika nukleinsyrafragment (DNA-fragment) i närvaro av en fluorescerande probe. Mängden ursprungligt templat i okända prov kvantifieras genom att signalen från proben jämförs med en standardkurva generad från prov med en känd mängd templat. PCR-analysen kan dock inhiberas av olika faktorer exempelvis hämoglobin och proteinkomplex som kan finnas i de kliniska provmaterialen. På grund av detta måste alla prov extraheras innan PCR-analys. Innan extraktion tillsättes sälherpes (PhHV-1) till varje patientprov (spikning), som extraktionskontroll och inhibitionskontroll för prov i PCR-analysen.
Kort beskrivning av PCR-metoden:
- Brucella identifieras genom påvisande av en genusspecifik insertionssekvens IS711 som förekommer i varierande antal, men alltid i samma antal inom varje species.
- Francisella tularensis påvisas med ett antal målsekvenser som tillåter särskiljandet av typ A och B. Insertionssekvensen ISFtu2. F. tularensis typ B kan specifikt påvisas med amplifiering av junction ISFtu2-3´reg som ingår i analysen. Genusspecifika tul4 är en gen som kodar för yttre membranproteiner. Ftt0524 kodar för ett speciesspecifikt protein med okänd funktion.
- Bacillus anthracis påvisas med amplifiering av en för organismen specifik beta-subenhet på RNA-polymerasgenen (rpoB), tillsammans med en kromosomal markör (BA5345) och de två virulensplasmiderna pX01-pag A (svarar bland annat för toxinproduktion) och pX02-capD (kapselprotein). För diagnosen krävs att båda virulensplasmiderna påvisas.