Odling och nukleinsyrapåvisning vid misstanke om riskklass 3-bakterier i prov
Artikel under utarbetande april 2012. Innehåll preliminärt ej godkänt genom konsensusförfarande
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar
Odling och nukleinsyrapåvisning vid misstanke om riskklass 3-bakterier i prov
Bakgrund
Inom ramen för ett samarbete mellan SMI, SVA, FOI och LMV lades år 2007 grunden för nätverket Forum för beredskapsdiagnostik (FBD). Det långsiktiga målet med nätverket är att skapa och förbättra förutsättningar för ett effektivt utnyttjande av landets kapacitet och kompetens för kvalitetssäkrad och uthållig diagnostik av riskgrupp 3 agens i första hand vid utbrottssituationer, men också vid frågeställningar rörande enskilda sjukdomsfall. Fram till 2011 har man bland annat gemensamt utvärderat av automatiserad utrustning för extraktion av DNA i BSL3-laboratorium och utvecklat molekylärbiologisk diagnostik av Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei och pseudomallei och Coxiella.
SMI utför i dag diagnostik med realtids PCR av dessa bakterier och Brucella species i humana prov på säkerhetslaboratoriet. Arbete pågår med att utöka den diagnostiska verksamheten inom ramen för samarbetet.
Indikation
Diagnostik i säkerhetslaboratoriet vid SMI av riskgrupp 3-bakterier (Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei och pseudomallei och Brucella species).
Kliniska prover med sådana frågeställningar bör skickas till SMI för hantering (blod, benmärg, sårsekret, annat). I de fall det rör sig om blododlingar (ofta Brucella eller Francisella) kan de inkuberas på det lokala laboratoriet, och, utan att den först öppnas, skickas till SMI om indikation på växt föreligger. Det förekommer inte sällan att riskgrupp 3-bakterier inte primärt misstänkts, varvid positiva blododlingar redan hanterats på laboratoriet för framställning av grampreparat, utodling på agarplattor etcetera. Så snart misstanke då uppstår skall positiva flaskor och utväxta plattor skickas till SMI för diagnostik. Se också artikel Omhändertagande av kliniska prov samt framodlade mikroorganismer med särskild hänsyn till förekomst av riskklass 3 och 4 patogener.
Diagnostik av riskgrupp 3-bakterier kan också motiveras vid möjlig terrorhandling (pulverbrev och dylikt).
Provmaterial
Blod eller benmärg i aerob blododlingsflaska. Koagulerad benmärg eller blod är inte lämpliga för diagnostik, eftersom de måste mortlas före hantering med risk för kontamination. De kan ändå mottas. Andra typer av prov är aspirat från abscess, lymfkörtel eller pinnprov. Agarplattor med utväxta kolonier.
Provtransport
Enligt gällande transportföreskrifter, se packa provet rätt.
Provhantering på SMI
All provhantering sker i säkerhetslaboratoriet. Nedan beskrivna rutin om direkt PCR gäller endast för Brucella. För övriga organismer gäller diagnostik ………..?
Observera att endast efterfrågad organism primärt diagnosticeras. Enligt önskemål från avsändare kan ytterligare diagnostik utföras (direkt PCR för annan P3-organism, artbestämning med sekvensering av 16s rDNA, i begränsad omfattning fenotypisk diagnostik stafylokocker. Den diagnostiska kapaciteten förväntas utvidgas i samband med ibruktagande av MaldiTof).
Blododlingsflaska
- Vid ankomst: Några droppas av innehållet appliceras och sprids på blodagar och hematinagar. Plattorna inkuberas anaerobt i 36 oC och avläses efter 1, 2 och 3 dagar.
Direkt PCR från flaskinnehåll görs direkt vid ankomsten enligt särskild rutin mot efterfrågad organism (?). Preliminärt provsvar (telefonsvar) lämnas till avsändare om provet blir positivt i direkt PCR.
Om direkt PCR blir negativ görs på samma templat direkt PCR för annan P3-organism eller artbestämning genom sekvensering av 16s rDNA om avsändaren så önskar.
- Blododlingsflaskan inkuberas 4 veckor varefter PCR körs från flaskan om behov föreligger.
Provet slutsvaras därefter.
Flytande prover (CSF, aspirat, och dylikt)
- Vid ankomst: Om möjligt odlas provet på blodagar och hematinagar.
Direkt PCR enligt rutiner för blododlingsflaska.
- Hanteras och slutsvaras vidare som ovan för blododlingsflaska.
Pinnprover
Hanteras som för blododlingsflaskor
Prover som mortlas (körtlar, benmärg, koagulerat blod)
- Vid ankomst: Vid behov sönderdelas provet med skalpell före mortling och mortlas i lämplig mängd PBS. Det mortlade materialet utodlas på blodagar och hematinagar och direkt PCR, varefter resterande material tillsätts en aerob blododlingsflaska.
Kolonier på agarplatta
- Vid växt av blandkultur görs omstrykning på blodagar och hematinagar.
- Vid växt av renkultur görs gramfärgning och direkt PCR med ledning av primärt fynd.
Svarsrutiner
Om ingen växt noterats under observationstiden besvaras provet: Ingen växt av efterfrågad organism. Om växt besvaras provet med växt av efterfrågad organism samt resultat av direkt PCR, eventuell resistensbestämning om det är begärt.