Skillnad mellan versioner av "PAR 10 Odling av Acanthamoeba"

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
 
(30 mellanliggande sidversioner av samma användare visas inte)
Rad 1: Rad 1:
−
'''Huvudartikel, skapad i mars 2012. Texten är preliminär, ännu ej beslutad genom konsensusförfarande.'''   
+
'''Huvudartikel''', publicerad mars 2012.
  
 
-----
 
-----
−
''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik]] och till ''
+
''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik]] ''
 
----
 
----
  
Rad 9: Rad 9:
 
Anrikning av ''Acanthamoeba'' från patientprov genom odling på non-nutrient agarplatta täckt med ''E. coli'' K12 bakterier som föda. Enstaka cystor som kan finnas i materialet excysterar och trofozoiter förökar sig och utvecklas så småningom till karakteristiska cystor som identifieras mikroskopiskt.  
 
Anrikning av ''Acanthamoeba'' från patientprov genom odling på non-nutrient agarplatta täckt med ''E. coli'' K12 bakterier som föda. Enstaka cystor som kan finnas i materialet excysterar och trofozoiter förökar sig och utvecklas så småningom till karakteristiska cystor som identifieras mikroskopiskt.  
 
===Reagenser===  
 
===Reagenser===  
−
1. Page´s saltlösning, steril
+
''' Page´s saltlösning''', steril
  
−
Lösning 1
+
''Lösning 1''
  
−
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>     2.84 g  
+
:Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 2.84 g  
 +
:KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 2.72 g
 +
:destillerat vatten 500 ml
 +
:Autoklavera, 20 min, 121ºC
 +
''Lösning 2''
  
−
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>   2.72 g
+
:MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O 8.0 g
 +
:CaCl<sub>2</sub> 2 H<sub>2</sub>O 8.0 g
 +
:NaCl 0. 240 g  
 +
:destillerat vatten 500 ml
 +
:Autoklavera, 20 min, 121ºC. Låt kallna till rumstemperatur, blanda lösning 1 och 2.
 +
:Förvaring: kylskåp
 +
'''Blodagar plattor'''
  
−
destillerat vatten  500 ml
+
:Förvaring: kylskåp
 +
:Hållbarhet: ca 4 veckor
 +
''' ''E. coli'' K12 kultur'''
  
−
Autoklavera, 20 min, 121ºC
+
:Förvaring: kylskåp
 +
:Hållbarhet: ca 4 veckor
 +
'''Non-nutrient agar i rör, steril'''
  
−
Lösning  2
+
:agar utan tillsatser 15g
 +
:destillerat vatten, eller PBS eller Page´s saltlösning 1 000 ml
 +
:Autoklavera, 20 min, 121 ºC. Portionera i sterila rör (20 ml/ rör)
  
−
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O    8.0 g
+
'''Positiv kontroll: ''Acanthamoeba'' spp. kultur'''.  
  
−
CaCl<sub>2</sub> 2 H<sub>2</sub>O    8.0 g
+
:Förvaring: kylskåp
 +
:Hållbarhet: flera månader, så länge agarn ej är intorkad.
  
−
NaCl    0. 240 g
+
===Analysprocedur===
 +
Arbetet utförs i säkerhetsbänk. Handskar används genomgående.
 +
====Förberedelser====
 +
A. Subkultivering av ''E. coli'' (1-2 dagar innan analysdag, äldre bakterier fungerar också).
  
−
destillerat vatten  500 ml
+
# Stryk ut ''E. coli'' K12 på en ny blodagar platta.
 +
# Inkubera plattorna upp och ned, minst 1 dygn, i 30 °C.
 +
 +
B. Gjutning av agarplattor (kan göras samma dag eller i förväg)
  
−
Autoklavera, 20 min, 121ºC. Låt kallna till rumstemperatur, blanda lösning 1 och 2.
+
# Beräkna en agarplatta per provmaterial, plus en platta till positiva kontrollen. Till varje platta åtgår ett rör med non-nutrient agar.
 +
# Smält non-nutrient agar i kokande vattenbad.
 +
# Häll den smälta agarn i en petriskål och låt den stelna.  
 +
# Förvara förgjutna plattor till analysdag i kylskåp.
 +
# Plattor inpackade i parafilm kan förvaras i en månad.
 +
====Analysdag====
 +
1. Rumstemperera agarplattorna
  
−
Förvaring: kylskåp
+
2. Häll ca 0,5 mL Page´s saltlösning på blodagarplattan och slamma upp lite kolibakterier med en 10 µL bakteriologisk ögla. Tillsätt 3-4 droppar bakterie-suspension mitt på varje nonnutrient agarplatta. Sprid ut bakterierna med en 10 µL bakteriologisk ögla. Obs! Bakterielagret får inte vara flytande (låt överflödig vätska absorberas in i plattan).
  
−
2. Blodagar plattor,
+
3. Märk plattorna med analysdatum och provnummer. Märk också en platta för positiv kontroll och sätt undan till punkt 8.
  
−
Förvaring: kylskåp
+
4. Lägg provmaterial på plattan:  
 +
:* Linsvätska centrifugeras först 500 x g, 5 min. Supernatanten sugs av och sedimentet inokuleras på plattan.
 +
 +
:* Rör med biopsimaterial i transportmedium centrifugeras 500 x g, 5 min och supernatanten sugs av. Vävnadsbiopsi samt sediment inokuleras i mitten av plattan. Försök att undvikaöverflödig vätska!
 +
:* Kontaktlinser placeras i mitten av plattan.
  
−
Hållbarhet: ca 4 veckor
+
5. Inkubera plattorna upp och ned i 30 °C i fuktkammare (plastpåse med en liten bit fuktad pappershandduk).
  
−
3. ''E. coli'' K12 kultur
+
6. Tvätta arbetsytan med 70 % sprit.
  
−
Förvaring: kylskåp
+
7. Byt handskar.
−
 
 
−
Hållbarhet: ca 4 veckor
 
  
−
4. Non-nutrient agar i rör, steril
+
8. Skär en ca 1 cm<sup>2</sup> stor agarbit från platta med uppodlad referensstam av ''Acanthamoeba''. Notera stamidentitet i analysprotokollet. Placera agarbiten upp och ned i mitten av plattan märkt positiv kontroll.
−
 
−
Agar utan tillsatser  15g
 
  
−
Destillerat vatten, eller PBS eller Page´s saltlösning 1 000 ml
+
9. Inkubera plattan upp och ned i 30 °C i separat fuktkammare.
  
−
Autoklavera, 20 min, 121 ºC. Portionera i sterila rör (20 ml/ rör)
+
10. Inkubera alla plattor i en vecka.
−
 
 
−
5. Positiv kontroll: ''Acanthamoeba''  spp. kultur.  
 
  
−
Förvaring: kylskåp
+
====Avläsning och bedömning.====
−
Hållbarhet: flera månader, så länge agarn ej är intorkad.
 
−
===Analysprocedur===
 
−
Arbetet utförs i säkerhetsbänk. Handskar används genomgående.
 
−
====Förberedelser====
 
−
A Subkultivering av ''E. coli'' (1-2 dagar innan analysdag, äldre bakterier fungerar också)
 
−
1. Stryk ut ''E. coli'' K12 på en ny blodagar platta.
 
−
2. Inkubera plattorna upp och ned, minst 1 dygn, i 30 °C.
 
−
B Gjutning av agarplattor (kan göras samma dag eller i förväg)
 
−
1. Beräkna en agarplatta per provmaterial, plus en platta till positiva kontrollen. Till varje platta åtgår ett rör med non-nutrient agar.
 
−
2. Smält non-nutrient agar i kokande vattenbad.
 
−
3. Häll den smälta agarn i en petriskål och låt den stelna.
 
−
4. Förvara förgjutna plattor till analysdag i kylskåp.
 
−
5. Plattor inpackade i parafilm kan förvaras i en månad.
 
−
====Analysdag====
 
−
1. Rumstemperera agarplattorna.
 
−
2. Häll ca 0,5 mL Page´s saltlösning på blodagarplattan och slamma upp lite kolibakterier med en 10 µL bakteriologisk ögla. Tillsätt 3-4 droppar bakterie-suspension mitt på varje nonnutrient agarplatta. Sprid ut bakterierna med en 10 µL bakteriologisk ögla. Obs! Bakterielagret får inte vara flytande (låt överflödig vätska absorberas in i plattan).
 
−
3. Märk plattorna med analysdatum och provnummer. Märk också en platta för positiv kontroll och sätt undan till punkt 8.
 
−
4. A. Linsvätska centrifugeras först 500 x g, 5 min. Supernatanten sugs av och sedimentet inokuleras på plattan.
 
−
      B. Rör med biopsimaterial i transportmedium centrifugeras 500 x g, 5 min och supernatanten sugs av. Vävnadsbiopsi samt sediment inokuleras i mitten av plattan. Försök att undvika överflödig vätska!
 
−
 
−
C. Kontaktlinser placeras i mitten av plattan.
 
−
5. Inkubera plattorna upp och ned i 30 °C i fuktkammare (plastpåse med en liten bit fuktad pappershandduk).
 
−
6. Tvätta arbetsytan med 70 % sprit.
 
−
7. Byt handskar.
 
−
8. Skär en ca 1 cm2 stor agarbit från platta med uppodlad referensstam av Acanthamoeba. Notera stamidentitet i analysprotokollet. Placera agarbiten upp och ned i mitten av plattan märkt positiv kontroll.
 
−
9. Inkubera plattan upp och ned i 30 °C i separat fuktkammare.
 
−
10. Inkubera alla plattor i en vecka.
 
−
Avläsning och bedömning.
 
 
Varje arbetsdag granskas hela plattan i inverterat mikroskop. Leta efter cystor och/eller trofozoiter. Börja varje avläsning med patientprov, tvätta därefter mikroskopbordet, byt handskar och kontrollera referenskulturen.
 
Varje arbetsdag granskas hela plattan i inverterat mikroskop. Leta efter cystor och/eller trofozoiter. Börja varje avläsning med patientprov, tvätta därefter mikroskopbordet, byt handskar och kontrollera referenskulturen.
−
Gör ett utstryk eller imprint av kulturen vid positivt fynd i patientprov. Låt preparaten lufttorka. För färgning med Giemsa se bilaga PAR09.  
+
Gör ett utstryk eller imprint av kulturen vid positivt fynd i patientprov. Låt preparaten lufttorka. För färgning med Giemsa se bilaga [[PAR 09 Malariamikroskopi|PAR 09 ]].  
−
Kriterier för identifiering av Acanthamoeba spp.
+
=====Kriterier för identifiering av ''Acanthamoeba'' spp.=====
 
Trofozoiter kan variera mellan 20–40 µm i diameter och kan ha olika former.  
 
Trofozoiter kan variera mellan 20–40 µm i diameter och kan ha olika former.  
 
Direktmikroskopi: Levande trofozoiter har en vakuol som tömmer sig flera gånger per minut. Cystorna, 12–18 µm i diameter, är polygonala, har dubbla väggar och ser ut som kristaller.  
 
Direktmikroskopi: Levande trofozoiter har en vakuol som tömmer sig flera gånger per minut. Cystorna, 12–18 µm i diameter, är polygonala, har dubbla väggar och ser ut som kristaller.  
 
Giemsafärgning: Cytoplasman i färgade trofozoiter innehåller flera vakuoler och har en centralt placerad kärna med en stor endosom (ref. 3).
 
Giemsafärgning: Cytoplasman i färgade trofozoiter innehåller flera vakuoler och har en centralt placerad kärna med en stor endosom (ref. 3).
−
Svarsrutin
+
 
−
Växt av trofozoiter och/eller cystor av Acanthamoeba spp. påvisade i odling.
+
====Svarsrutin====
−
Ingen växt av Acanthamoeba spp. i odling.
+
Växt av trofozoiter och/eller cystor av ''Acanthamoeba'' spp. påvisade i odling.
−
Kvalitetssäkring
+
 
 +
Ingen växt av ''Acanthamoeba'' spp. i odling.
 +
====Kvalitetssäkring====
 
Intern: Referensstam odlas samtidigt med proverna.
 
Intern: Referensstam odlas samtidigt med proverna.
 
Extern: saknas
 
Extern: saknas
−
Prestanda
+
====Prestanda====
−
Negativt fynd utesluter ej Acanthamoeba spp.- infektion.
+
Negativt fynd utesluter ej ''Acanthamoeba'' spp.- infektion.
 
Sensitivitet: är i genomsnitt 76 % för odling av ögonskrap. Högre sensitivitet kan fås vid odling av djup biopsi från hornhinnan (ref. 2).   
 
Sensitivitet: är i genomsnitt 76 % för odling av ögonskrap. Högre sensitivitet kan fås vid odling av djup biopsi från hornhinnan (ref. 2).   
 
Specificitet: vid mikroskopisk påvisning kan endast genus anges.
 
Specificitet: vid mikroskopisk påvisning kan endast genus anges.
  
−
Säkerhetsaspekter och avfallshantering
+
====Säkerhetsaspekter och avfallshantering====
−
Acanthamoeba spp tillhör skyddsklass 2 patogener. Både cystor och trofozoiter kan vara infektiösa för människor.
+
''Acanthamoeba'' spp tillhör skyddsklass 2 patogener. Både cystor och trofozoiter kan vara infektiösa för människor.
 
Avdöda odlingsplattor med provmaterial och referensstam med 70 % sprit och placera dem i riskavfallskartonger efter avslutad inkubation.
 
Avdöda odlingsplattor med provmaterial och referensstam med 70 % sprit och placera dem i riskavfallskartonger efter avslutad inkubation.
  
−
Referenser
+
==Referenser==
−
1. Visvesvara G S. Laboratory diagnosis. In: E. G. Rondanelli, editors. Amphizoic amoebae. Human pathology. Padova: Piccin Nuova Libraria 1987:194-215.
+
*Visvesvara G S. Laboratory diagnosis. In: E. G. Rondanelli, editors. Amphizoic amoebae. Human pathology. Padova: Piccin Nuova Libraria 1987:194-215.
−
2. Auran JD, Starr MB, Jakobiec FA. Acanthamoeba Keratitis. A Review of the Literature. Cornea 1987;6 (1):2-26.
+
*Auran JD, Starr MB, Jakobiec FA. Acanthamoeba Keratitis. A Review of the Literature. Cornea 1987;6 (1):2-26.
−
3. Ash L, Orihel T. Atlas of human Parasitology.
+
*Ash L, Orihel T. Atlas of human Parasitology, ASCP Press, Chicago.
  
 
[[Kategori:Parasiter]]
 
[[Kategori:Parasiter]]
−
 
+
[[Kategori:Laboratoriediagnostik]]
 +
[[Kategori:Laboratoriediagnostik-parasiter]]
 
----------
 
----------

Nuvarande version från 6 december 2012 kl. 14.51

Huvudartikel, publicerad mars 2012.

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik

Odling av Acanthamoeba på non-nutrient agar[redigera]

Analysprincip[redigera]

Anrikning av Acanthamoeba från patientprov genom odling på non-nutrient agarplatta täckt med E. coli K12 bakterier som föda. Enstaka cystor som kan finnas i materialet excysterar och trofozoiter förökar sig och utvecklas så småningom till karakteristiska cystor som identifieras mikroskopiskt.

Reagenser[redigera]

Page´s saltlösning, steril

Lösning 1

Na2HPO4 2.84 g
KH2PO4 2.72 g
destillerat vatten 500 ml
Autoklavera, 20 min, 121ºC

Lösning 2

MgSO4 7H2O 8.0 g
CaCl2 2 H2O 8.0 g
NaCl 0. 240 g
destillerat vatten 500 ml
Autoklavera, 20 min, 121ºC. Låt kallna till rumstemperatur, blanda lösning 1 och 2.
Förvaring: kylskåp

Blodagar plattor

Förvaring: kylskåp
Hållbarhet: ca 4 veckor

E. coli K12 kultur

Förvaring: kylskåp
Hållbarhet: ca 4 veckor

Non-nutrient agar i rör, steril

agar utan tillsatser 15g
destillerat vatten, eller PBS eller Page´s saltlösning 1 000 ml
Autoklavera, 20 min, 121 ºC. Portionera i sterila rör (20 ml/ rör)

Positiv kontroll: Acanthamoeba spp. kultur.

Förvaring: kylskåp
Hållbarhet: flera månader, så länge agarn ej är intorkad.

Analysprocedur[redigera]

Arbetet utförs i säkerhetsbänk. Handskar används genomgående.

Förberedelser[redigera]

A. Subkultivering av E. coli (1-2 dagar innan analysdag, äldre bakterier fungerar också).

  1. Stryk ut E. coli K12 på en ny blodagar platta.
  2. Inkubera plattorna upp och ned, minst 1 dygn, i 30 °C.

B. Gjutning av agarplattor (kan göras samma dag eller i förväg)

  1. Beräkna en agarplatta per provmaterial, plus en platta till positiva kontrollen. Till varje platta åtgår ett rör med non-nutrient agar.
  2. Smält non-nutrient agar i kokande vattenbad.
  3. Häll den smälta agarn i en petriskål och låt den stelna.
  4. Förvara förgjutna plattor till analysdag i kylskåp.
  5. Plattor inpackade i parafilm kan förvaras i en månad.

Analysdag[redigera]

1. Rumstemperera agarplattorna

2. Häll ca 0,5 mL Page´s saltlösning på blodagarplattan och slamma upp lite kolibakterier med en 10 µL bakteriologisk ögla. Tillsätt 3-4 droppar bakterie-suspension mitt på varje nonnutrient agarplatta. Sprid ut bakterierna med en 10 µL bakteriologisk ögla. Obs! Bakterielagret får inte vara flytande (låt överflödig vätska absorberas in i plattan).

3. Märk plattorna med analysdatum och provnummer. Märk också en platta för positiv kontroll och sätt undan till punkt 8.

4. Lägg provmaterial på plattan:

  • Linsvätska centrifugeras först 500 x g, 5 min. Supernatanten sugs av och sedimentet inokuleras på plattan.
  • Rör med biopsimaterial i transportmedium centrifugeras 500 x g, 5 min och supernatanten sugs av. Vävnadsbiopsi samt sediment inokuleras i mitten av plattan. Försök att undvikaöverflödig vätska!
  • Kontaktlinser placeras i mitten av plattan.

5. Inkubera plattorna upp och ned i 30 °C i fuktkammare (plastpåse med en liten bit fuktad pappershandduk).

6. Tvätta arbetsytan med 70 % sprit.

7. Byt handskar.

8. Skär en ca 1 cm2 stor agarbit från platta med uppodlad referensstam av Acanthamoeba. Notera stamidentitet i analysprotokollet. Placera agarbiten upp och ned i mitten av plattan märkt positiv kontroll.

9. Inkubera plattan upp och ned i 30 °C i separat fuktkammare.

10. Inkubera alla plattor i en vecka.

Avläsning och bedömning.[redigera]

Varje arbetsdag granskas hela plattan i inverterat mikroskop. Leta efter cystor och/eller trofozoiter. Börja varje avläsning med patientprov, tvätta därefter mikroskopbordet, byt handskar och kontrollera referenskulturen. Gör ett utstryk eller imprint av kulturen vid positivt fynd i patientprov. Låt preparaten lufttorka. För färgning med Giemsa se bilaga PAR 09 .

Kriterier för identifiering av Acanthamoeba spp.[redigera]

Trofozoiter kan variera mellan 20–40 µm i diameter och kan ha olika former. Direktmikroskopi: Levande trofozoiter har en vakuol som tömmer sig flera gånger per minut. Cystorna, 12–18 µm i diameter, är polygonala, har dubbla väggar och ser ut som kristaller. Giemsafärgning: Cytoplasman i färgade trofozoiter innehåller flera vakuoler och har en centralt placerad kärna med en stor endosom (ref. 3).

Svarsrutin[redigera]

Växt av trofozoiter och/eller cystor av Acanthamoeba spp. påvisade i odling.

Ingen växt av Acanthamoeba spp. i odling.

Kvalitetssäkring[redigera]

Intern: Referensstam odlas samtidigt med proverna. Extern: saknas

Prestanda[redigera]

Negativt fynd utesluter ej Acanthamoeba spp.- infektion. Sensitivitet: är i genomsnitt 76 % för odling av ögonskrap. Högre sensitivitet kan fås vid odling av djup biopsi från hornhinnan (ref. 2). Specificitet: vid mikroskopisk påvisning kan endast genus anges.

Säkerhetsaspekter och avfallshantering[redigera]

Acanthamoeba spp tillhör skyddsklass 2 patogener. Både cystor och trofozoiter kan vara infektiösa för människor. Avdöda odlingsplattor med provmaterial och referensstam med 70 % sprit och placera dem i riskavfallskartonger efter avslutad inkubation.

Referenser[redigera]

  • Visvesvara G S. Laboratory diagnosis. In: E. G. Rondanelli, editors. Amphizoic amoebae. Human pathology. Padova: Piccin Nuova Libraria 1987:194-215.
  • Auran JD, Starr MB, Jakobiec FA. Acanthamoeba Keratitis. A Review of the Literature. Cornea 1987;6 (1):2-26.
  • Ash L, Orihel T. Atlas of human Parasitology, ASCP Press, Chicago.
Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=PAR_10_Odling_av_Acanthamoeba&oldid=12614"