PAR 10 Odling av Acanthamoeba
Odling av Acanthamoeba på non-nutrient agar Analysprincip Anrikning av Acanthamoeba från patientprov genom odling på non-nutrient agarplatta täckt med E. coli K12 bakterier som föda. Enstaka cystor som kan finnas i materialet excysterar och trofozoiter förökar sig och utvecklas så småningom till karakteristiska cystor som identifieras mikroskopiskt. Reagenser Page´s saltlösning, steril Lösning 1 Na2HPO4 2.84 g KH2PO4 2.72 g destillerat vatten 500 ml Autoklavera, 20 min, 121ºC Lösning 2 MgSO4 7H2O 8.0 g CaCl2 2 H2O 8.0 g NaCl 0. 240 g destillerat vatten 500 ml Autoklavera, 20 min, 121ºC Låt kallna till rumstemperatur, blanda lösning 1 och 2 Förvaring: kylskåp Blodagar plattor, Förvaring: kylskåp Hållbarhet: ca 4 veckor E. coli K12 kultur Förvaring: kylskåp Hållbarhet: ca 4 veckor Non-nutrient agar i rör, steril, Agar utan tillsatser 15g Destillerat vatten, eller PBS eller Page´s saltlösning 1 000 ml Autoklavera, 20 min, 121 ºC. Portionera i sterila rör (20 ml/ rör) Positiv kontroll Acanthamoeba spp. kultur. Förvaring: kylskåp Hållbarhet: flera månader, så länge agarn ej är intorkad. . Analysprocedur Arbetet utförs i säkerhetsbänk. Handskar används genomgående.
Förberedelser A Subkultivering av E. coli (1-2 dagar innan analysdag, äldre bakterier fungerar också) 1. Stryk ut E. coli K12 på en ny blodagar platta. 2. Inkubera plattorna upp och ned, minst 1 dygn, i 30 °C. B Gjutning av agarplattor (kan göras samma dag eller i förväg) 1. Beräkna en agarplatta per provmaterial, plus en platta till positiva kontrollen. Till varje platta åtgår ett rör med non-nutrient agar. 2. Smält non-nutrient agar i kokande vattenbad. 3. Häll den smälta agarn i en petriskål och låt den stelna. 4. Förvara förgjutna plattor till analysdag i kylskåp. 5. Plattor inpackade i parafilm kan förvaras i en månad. Analysdag 1. Rumstemperera agarplattorna. 2. Häll ca 0,5 mL Page´s saltlösning på blodagarplattan och slamma upp lite kolibakterier med en 10 µL bakteriologisk ögla. Tillsätt 3-4 droppar bakterie-suspension mitt på varje nonnutrient agarplatta. Sprid ut bakterierna med en 10 µL bakteriologisk ögla. Obs! Bakterielagret får inte vara flytande (låt överflödig vätska absorberas in i plattan). 3. Märk plattorna med analysdatum och provnummer. Märk också en platta för positiv kontroll och sätt undan till punkt 8. 4. A. Linsvätska centrifugeras först 500 x g, 5 min. Supernatanten sugs av och sedimentet inokuleras på plattan.
B. Rör med biopsimaterial i transportmedium centrifugeras 500 x g, 5 min och
supernatanten sugs av. Vävnadsbiopsi samt sediment inokuleras i mitten av plattan.
Försök att undvika överflödig vätska!
C. Kontaktlinser placeras i mitten av plattan.
5. Inkubera plattorna upp och ned i 30 °C i fuktkammare (plastpåse med en liten bit fuktad pappershandduk). 6. Tvätta arbetsytan med 70 % sprit. 7. Byt handskar. 8. Skär en ca 1 cm2 stor agarbit från platta med uppodlad referensstam av Acanthamoeba. Notera stamidentitet i analysprotokollet. Placera agarbiten upp och ned i mitten av plattan märkt positiv kontroll. 9. Inkubera plattan upp och ned i 30 °C i separat fuktkammare. 10. Inkubera alla plattor i en vecka. Avläsning och bedömning. Varje arbetsdag granskas hela plattan i inverterat mikroskop. Leta efter cystor och/eller trofozoiter. Börja varje avläsning med patientprov, tvätta därefter mikroskopbordet, byt handskar och kontrollera referenskulturen. Gör ett utstryk eller imprint av kulturen vid positivt fynd i patientprov. Låt preparaten lufttorka. För färgning med Giemsa se bilaga PAR09. Kriterier för identifiering av Acanthamoeba spp. Trofozoiter kan variera mellan 20–40 µm i diameter och kan ha olika former. Direktmikroskopi: Levande trofozoiter har en vakuol som tömmer sig flera gånger per minut. Cystorna, 12–18 µm i diameter, är polygonala, har dubbla väggar och ser ut som kristaller. Giemsafärgning: Cytoplasman i färgade trofozoiter innehåller flera vakuoler och har en centralt placerad kärna med en stor endosom (ref. 3). Svarsrutin Växt av trofozoiter och/eller cystor av Acanthamoeba spp. påvisade i odling. Ingen växt av Acanthamoeba spp. i odling. Kvalitetssäkring Intern: Referensstam odlas samtidigt med proverna. Extern: saknas Prestanda Negativt fynd utesluter ej Acanthamoeba spp.- infektion. Sensitivitet: är i genomsnitt 76 % för odling av ögonskrap. Högre sensitivitet kan fås vid odling av djup biopsi från hornhinnan (ref. 2). Specificitet: vid mikroskopisk påvisning kan endast genus anges.
Säkerhetsaspekter och avfallshantering Acanthamoeba spp tillhör skyddsklass 2 patogener. Både cystor och trofozoiter kan vara infektiösa för människor. Avdöda odlingsplattor med provmaterial och referensstam med 70 % sprit och placera dem i riskavfallskartonger efter avslutad inkubation.
Referenser 1. Visvesvara G S. Laboratory diagnosis. In: E. G. Rondanelli, editors. Amphizoic amoebae. Human pathology. Padova: Piccin Nuova Libraria 1987:194-215. 2. Auran JD, Starr MB, Jakobiec FA. Acanthamoeba Keratitis. A Review of the Literature. Cornea 1987;6 (1):2-26. 3. Ash L, Orihel T. Atlas of human Parasitology.