PAR 10 Odling av Acanthamoeba

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
Den utskrivbara versionen stöds inte längre och kanske innehåller renderingsfel. Uppdatera din webbläsares bokmärken och använd standardutskriftsfunktionen istället.

Huvudartikel, publicerad mars 2012.

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik

Odling av Acanthamoeba på non-nutrient agar

Analysprincip

Anrikning av Acanthamoeba från patientprov genom odling på non-nutrient agarplatta täckt med E. coli K12 bakterier som föda. Enstaka cystor som kan finnas i materialet excysterar och trofozoiter förökar sig och utvecklas så småningom till karakteristiska cystor som identifieras mikroskopiskt.

Reagenser

Page´s saltlösning, steril

Lösning 1

Na2HPO4 2.84 g
KH2PO4 2.72 g
destillerat vatten 500 ml
Autoklavera, 20 min, 121ºC

Lösning 2

MgSO4 7H2O 8.0 g
CaCl2 2 H2O 8.0 g
NaCl 0. 240 g
destillerat vatten 500 ml
Autoklavera, 20 min, 121ºC. Låt kallna till rumstemperatur, blanda lösning 1 och 2.
Förvaring: kylskåp

Blodagar plattor

Förvaring: kylskåp
Hållbarhet: ca 4 veckor

E. coli K12 kultur

Förvaring: kylskåp
Hållbarhet: ca 4 veckor

Non-nutrient agar i rör, steril

agar utan tillsatser 15g
destillerat vatten, eller PBS eller Page´s saltlösning 1 000 ml
Autoklavera, 20 min, 121 ºC. Portionera i sterila rör (20 ml/ rör)

Positiv kontroll: Acanthamoeba spp. kultur.

Förvaring: kylskåp
Hållbarhet: flera månader, så länge agarn ej är intorkad.

Analysprocedur

Arbetet utförs i säkerhetsbänk. Handskar används genomgående.

Förberedelser

A. Subkultivering av E. coli (1-2 dagar innan analysdag, äldre bakterier fungerar också).

  1. Stryk ut E. coli K12 på en ny blodagar platta.
  2. Inkubera plattorna upp och ned, minst 1 dygn, i 30 °C.

B. Gjutning av agarplattor (kan göras samma dag eller i förväg)

  1. Beräkna en agarplatta per provmaterial, plus en platta till positiva kontrollen. Till varje platta åtgår ett rör med non-nutrient agar.
  2. Smält non-nutrient agar i kokande vattenbad.
  3. Häll den smälta agarn i en petriskål och låt den stelna.
  4. Förvara förgjutna plattor till analysdag i kylskåp.
  5. Plattor inpackade i parafilm kan förvaras i en månad.

Analysdag

1. Rumstemperera agarplattorna

2. Häll ca 0,5 mL Page´s saltlösning på blodagarplattan och slamma upp lite kolibakterier med en 10 µL bakteriologisk ögla. Tillsätt 3-4 droppar bakterie-suspension mitt på varje nonnutrient agarplatta. Sprid ut bakterierna med en 10 µL bakteriologisk ögla. Obs! Bakterielagret får inte vara flytande (låt överflödig vätska absorberas in i plattan).

3. Märk plattorna med analysdatum och provnummer. Märk också en platta för positiv kontroll och sätt undan till punkt 8.

4. Lägg provmaterial på plattan:

  • Linsvätska centrifugeras först 500 x g, 5 min. Supernatanten sugs av och sedimentet inokuleras på plattan.
  • Rör med biopsimaterial i transportmedium centrifugeras 500 x g, 5 min och supernatanten sugs av. Vävnadsbiopsi samt sediment inokuleras i mitten av plattan. Försök att undvikaöverflödig vätska!
  • Kontaktlinser placeras i mitten av plattan.

5. Inkubera plattorna upp och ned i 30 °C i fuktkammare (plastpåse med en liten bit fuktad pappershandduk).

6. Tvätta arbetsytan med 70 % sprit.

7. Byt handskar.

8. Skär en ca 1 cm2 stor agarbit från platta med uppodlad referensstam av Acanthamoeba. Notera stamidentitet i analysprotokollet. Placera agarbiten upp och ned i mitten av plattan märkt positiv kontroll.

9. Inkubera plattan upp och ned i 30 °C i separat fuktkammare.

10. Inkubera alla plattor i en vecka.

Avläsning och bedömning.

Varje arbetsdag granskas hela plattan i inverterat mikroskop. Leta efter cystor och/eller trofozoiter. Börja varje avläsning med patientprov, tvätta därefter mikroskopbordet, byt handskar och kontrollera referenskulturen. Gör ett utstryk eller imprint av kulturen vid positivt fynd i patientprov. Låt preparaten lufttorka. För färgning med Giemsa se bilaga PAR 09 .

Kriterier för identifiering av Acanthamoeba spp.

Trofozoiter kan variera mellan 20–40 µm i diameter och kan ha olika former. Direktmikroskopi: Levande trofozoiter har en vakuol som tömmer sig flera gånger per minut. Cystorna, 12–18 µm i diameter, är polygonala, har dubbla väggar och ser ut som kristaller. Giemsafärgning: Cytoplasman i färgade trofozoiter innehåller flera vakuoler och har en centralt placerad kärna med en stor endosom (ref. 3).

Svarsrutin

Växt av trofozoiter och/eller cystor av Acanthamoeba spp. påvisade i odling.

Ingen växt av Acanthamoeba spp. i odling.

Kvalitetssäkring

Intern: Referensstam odlas samtidigt med proverna. Extern: saknas

Prestanda

Negativt fynd utesluter ej Acanthamoeba spp.- infektion. Sensitivitet: är i genomsnitt 76 % för odling av ögonskrap. Högre sensitivitet kan fås vid odling av djup biopsi från hornhinnan (ref. 2). Specificitet: vid mikroskopisk påvisning kan endast genus anges.

Säkerhetsaspekter och avfallshantering

Acanthamoeba spp tillhör skyddsklass 2 patogener. Både cystor och trofozoiter kan vara infektiösa för människor. Avdöda odlingsplattor med provmaterial och referensstam med 70 % sprit och placera dem i riskavfallskartonger efter avslutad inkubation.

Referenser

  • Visvesvara G S. Laboratory diagnosis. In: E. G. Rondanelli, editors. Amphizoic amoebae. Human pathology. Padova: Piccin Nuova Libraria 1987:194-215.
  • Auran JD, Starr MB, Jakobiec FA. Acanthamoeba Keratitis. A Review of the Literature. Cornea 1987;6 (1):2-26.
  • Ash L, Orihel T. Atlas of human Parasitology, ASCP Press, Chicago.
Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=PAR_10_Odling_av_Acanthamoeba&oldid=12614"