Diarréframkallande Escherichia coli-laboratoriediagnostik

Laboratoriediagnostik av diarréframkallande Escherichia coli

Allmänt

Då selektiva medier för patogena E. coli saknas och andelen av den totala floran i ett fecesprov ofta är mycket låg ställs speciella krav på diagnostiken, vilken bör innehålla tre steg: 1) screening med en känslighet av en bakterie mot en bak¬grund av minst 103 andra bakterier; 2) isolering och 3) verifiering. Ett alternativ till screening är att för varje prov testa minst 10 kolonier från primärodlingen vilket dock medför en högre detektionsgräns. Diagnostik av patogena E. coli baseras lämpligast på identifiering av virulensfaktorer eller andra egenskaper specifika för respektive kategori och ej med serologisk O-typning som tidigare var mycket vanlig. O-typning är att betrakta som en epidemiologisk metod men kan ibland komplettera övriga analysresultat som en klonal markör då kunskap om ytterligare virulensegenskaper saknas. Dock kan O-antikroppar bundna till magnetiska kulor användas vid anriknings- och/eller isoleringssteg.

Undersökning av EAggEC är idag att betrakta som specialdiagnostik för FoU. Därför anges ingen referensmetod i detta avsnitt.

Referensmetodik

Referenssubstrat

• MacConkey-agar (MAC, se kapitel 1.1.15), rekommenderas för primärodling av fecesprov. Om analysen omfattar samtliga diarréframkallande E. coli, inklusive EHEC rekommenderas i stället användning av sorbitol-MacConkey (SMAC, se Bilaga 1.1.11), dock ej CT-SMAC.
• Buffrat peptonvatten (BPV) används vid preanrikning. [[[Bilaga 1.1]].12]

Primär utodling

Provet stryks på MacConkey-agar (MAC) eller sorbitol-Mac¬Conkey (SMAC) agar. Sekundär- och tertiärstryk görs med ögla. Plattan inkube¬ras över natt vid 36 °C - 38 °C och sparas därefter i kyl. Vid mycket små provmängder eller dålig växt på primärplatta odlas provet i BPV vid 42 oC i 24 tim. Detta material an-vänds direkt för PCR-screening, respektive utodling på MAC/SMAC.

PCR-screening

Målgener enligt tabell 17 påvisas med PCR på primärkultur eller enskilda kolo-nier. Metodbeskrivning ”Diarréframkallande Escherichia coli och shigatoxigena Enterobacteriaceae - påvisning med PCR”, som tillämpas vid SMI bifogas som exempel (Bilaga 3).

Isolering från PCR-positiva prov

Cirka 10 kolonier, med morfologi som E. coli, plockas och testas med PCR. Vid negativt resultat testas ett flertal pooler bestående av minst 10 kolonier vardera. Sammanlagt minst 100 kolonier bör ha testats innan isoleringsförsök avbryts. De ingående isolaten i positiva pooler testas sedan separat.

Identifiering och minimikriterier

PCR-positiva isolat karakteriseras med API 20E. Om biokemin är typisk för E. coli anses isolatet identifierat som ETEC (eltB/estA) eller EPEC (eae/bfpA). EPEC kan också utgöras av eae-positiva, bfpA-negativa E. coli om dessa begränsas till vissa serotyper (se tabell 18). Om ial-positivt isolat ej jäser som Shigella, kan EIEC misstänkas.

Alternativ diagnostik

Screening och/eller isolering kan utföras med ”kolonihybridisering” med eae-, ial-, eltB- eller estA-probe. Då används radioaktiv DNA-probe (Se Målgen tabell 17) eller antikropp mot t.ex. toxin eller pili. Material slammas från primär¬stry-ket i PBS, späds och sprids på MAC/SMAC med en täthet av 100-1000 CFU/platta.

Screening kan också ske i bakteriesuspension med ELISA. Ovanstående metoder har dock högre detektionsgräns än PCR men identifierar åtminstone en klon av ETEC som ST-PCR missar. Användning av ”kolonihybridisering” innebär också att man vid positivt prov nästan alltid erhåller ett isolat. Isoleringssteget vid PCR-positiva prov kan underlättas med IMS, som finns tillgängligt för ett begränsat antal EPEC/EHEC-serotyper från Dynal Biotech.

• Verifikationssteget kan utföras med en rad alternativa metoder
  • ETEC kan verifieras med DNA-probe GM1-gangliosid ELISA (LT), ELISA (ST) och Y1-adrenalcelltest (LT).
  • EPEC- och EAggEC-diagnostiken verifieras med DNA-probe alternativt av adhesionsmönstret på Hep2- eller Hela-celler.
  • EIEC verifieras med Serény test.

Epidemiologisk typning

SMI utför vid utbrott epidemiologisk typning av tarmpatogena E. coli med PFGE och serotypning.

Kvalitetskontroll

Referensstammar se tabell 17.