Salmonella-laboratoriediagnostik

Huvudartikel: Salmonella

---

Laboratoriediagnostik av Salmonella

Allmänt

Vid septiska tillstånd bör blododling utföras. När det gäller primärisolering av Salmonella-bakterier från feces finns det vissa brister i diagnostiken som fram¬går av avsnittet Kvalitetssäkring. Säkerhetsaspekter Observera att Salmonella Typhi sedan den 31 mars 1998 klassas som Biosafety level (BSL) 3** patogen (se vidare detta avsnitt).Vid misstanke om S. Typhi är det viktigt att detta anges på remissen. Misstänkt S. Typhi är en stam som jäser mannit utan gas-utveckling och som är OD-negativ.

Referensmetodik

Referenssubstrat

Nedanstående substrat utgör referenssubstrat vid primärisolering av Salmonella-bakterier från humana fecesprov (se Bilaga 1.1 substratbeskrivningar). Generellt rekommenderas något av de kommersiella halvfabrikat som finns på marknaden. Angående testning av loter och fortlöpande kvalitetskontroll, se bilaga 1.2 - substratkontroll. XLD-agar [[[Bilaga 1]].1.1]: På XLD-agar växer Salmonella-bakterier inom ett dygn som regel med ett growth index (GI) jämfört mot blod eller CLED-agar över¬stigande 50 %. DC-agar [Bilaga 1.1.2]: Den något mer selektiva Hynes´ modifikation utgör refe¬renssubstrat. På DC-agar växer Salmonella-bakterier inom två dygn med GI överstigande 50 % jämfört med icke selektivt substrat i de allra flesta fall. MacConkey-agar [Bil 1.1.15]: Salmonella-bakterier växer inom ett dygn med GI överstigande 80 % jämfört med icke selektivt substrat i de allra flesta fall (un¬dantag t.ex. S. Senftenberg CCUG 37886). Kolonierna är därvid konvexa, se¬miopaka, blanka, ibland råa och färglösa. Kolonidiametern motsvarar den för DC-Hynes. Inkuberas i 35 °C – 37 °C i ett dygn. För anrikning är Rappaportbuljong [Bil 1.1.4] referenssubstrat lämpad för alla typer av Salmonella (ej S. Typhi) med inkubering vid 41,5 °C + 0,5 °C.

Isolering

Primär odling

Salmonella-bakterier tillväxer både aerobt och anaerobt inom ett brett temperaturområde, +8 C – 45 C men optimalt vid 37 C, och inom ett pH-intervall 4-8. Primär utodling: Provmaterial på provtagningspinne stryks ut på XLD-agar och DC-agar varefter sekundärstryk görs. Plattorna inkuberas i 35 C – 37 C. XLD-plattan avläses efter 1 dygn samt DC-plattan efter ett och två dygn.

Anrikning och sekundär utodling: Efter det primära utstryket stoppas provtag¬ningspinnen ner i Rappaportbuljong och inkuberas i 41,5 °C + 0,5 °C över natt. Med plastinös görs därefter utstryk och sekundärstryk på XLD-agar. Plattan inkuberas vid 35 C - 37 C över natt och avläses.

Identifiering och minimikriterier

Presumtiv diagnos

På XLD-agar är kolonierna semiopaka, släta, blanka och färglösa (framstår röda mot mediets grundfärg). Kolonierna är ofta stora med diameter >2 mm och ett distinkt svart centrum. Observera att atypiska LD-nega¬tiva och/eller laktosjäsande Salmonella, i likhet med andra koliforma bakterier, kan växa med gulfärgade, opaka kolonier. Observera att S. Typhi sällan blir H2S-positiv på XLD. Inkuberas i 35 °C - 37 °C och avläses efter ett dygn. På DC-agar är kolonierna semiopaka, blanka, färglösa, och i mer än hälften av fallen med grått eller svart centrum. De flesta stammar växer ut redan inom ett dygn. Kolonidiametern är ofta mindre än motsvarande på XLD. Inkuberas i 35 °C – 37 °C och avläses efter ett och två dygn.

Slutlig diagnos

Misstänkta kolonier plockas och karakteriseras med testbatteri (enligt Tabell 8) som inkuberas över natten i 35 °C – 37 C. Om biokemin är typisk enligt rad 1 är ingen ytterligare diagnostik nödvändig. Isolatet anses identi¬fierat som Salmonella species. Vid biokemiskt utfall enligt rad 2 - 4 måste kompletterande test med agglutina¬tion i polyvalent O-serum utföras. Ungefär 95 % av kliniska isolat agglutinerar i poly O. Korsreaktivitet med andra species inom Enterobacteriaceae t.ex. E. coli kan förekomma. Kompletteringstestet skall vara positivt. Tillsammans med något av de biokemiska utfallen i Tabell 8 rad 2 - 4 anses isolatet identifierat som Salmonella species.

Om kompletteringstestet utfaller negativt eller om biokemin inte är konklusiv görs komplettering med kommersiell analysbricka, t.ex. API 20E (Bio Merieux, Frankrike). Kvarstår misstanke om Salmonella species skickas isolatet till SMI för verifiering.

Avvikelser från referensmetodiken

Referensmetodiken anger en miniminivå för diagnostiken. Vissa avvikelser kan dock vara acceptabla.

Substrat

Vid primärisolering kan ett av de selektiva referensagarmedierna ersättas av ytterligare en anrikningsbuljong (Rappaport i kombination med Selenit).Selenit-buljong [[[Bilaga 1]].1.4] (laktosbaserad) är lämpad för anrikning av alla typer av Salmonella species direkt i fecesprov vid en inkuberingstemperatur av 35 °C (ibland anges 42 °C som lämplig inkuberingstemperatur även för Sele¬nit-buljong).

XLD-agar kan bytas mot t.ex. Hektoen-agar [Bilaga 1.1.3]. SSI-Enteric medium [Bilaga 1.1.7] kan också vara ett alternativ men svenska erfa¬renheter är begränsade.

Kompletterande test

Som kompletterande test kan någon av nedanstående ersätta agglutination i polyvalent serum:

• Salmonella-fag(Reagensia AB). Majoriteten av alla kliniska isolat av Salmonella (ca 95 %) är känsliga för bakteriofag Felix O-1 (FO). Denna test är därför ett bra komplement till den biokemiska identifieringen. Bland andra enterobakterier är det främst E. coli som kan vara känslig. Av praktiska skäl är det lämpligt att redan i samband med renspridning på MacConkey-plattan applicera en droppe fag på primärstryket.

• MUCAP-test (Svenska Labfab AB). Salmonella tycks vara unik inom Enterobacteriaceae genom att ha ett C8-este¬ras som hydrolyserar metylumbelliferylkaprilat. Fritt metylumbelliferyl fluorescerar i UV-ljus. Testen genomförs så att en droppe av reagensen appliceras på bakterierna på en utvuxen agarkultur, t.ex. MacConkey. Fluorescens avläses i relativt mörker inom fem minuter. Som UV-källa kan ofta användas en UV-lampa av sådan typ som används för kontroll av sedlar (referensfrekvens Woods light = 366 nm). När detta reagens testades på 750 isolat av Salmonella var 749 positiva i testen. Av 130 andra enterobakterier var endast en stam av Hafnia alvei positiv. Många oxidaspositiva bakterier som Pseudomonas species och liknande bakterier kan ge positivt testresultat, medan negativt test kan före¬komma hos laktospositiva Salmonella-isolat.

Alternativ diagnostik

Ingen kommersiell snabbdiagnostik finns idag tillgänglig för humana fecesprov. På veterinär- och livsmedelssidan förekommer de dock.

Serologi

Vissa laboratorier påvisar förekomst av IgG och IgM antikroppar med en LPS-ELISA som detekterar antikroppar mot faktorerna O4 och O9. Denna serologi kan i vissa fall användas för diagnostik av Salmonella-infektion. Den klassiska Widal testen, påvisande av antikroppar mot Salmonella Typhi med av¬dödade bakterier som antigen, torde inte fylla någon plats i modern infektionsdiagnostik.

Epidemiologisk typning

Stam som av insändaren identifierats som Salmonella species sänds till SMI för epidemiologisk typning. Undantag är klara utbrott eller epidemier där endast ett representativt urval av stammar sänds. Hos känd smittbärare skall ej konsekutiva isolat sändas för typning. Avsikten med typning är att följa smittspridning, främst inom landet. I de fall laboratoriet känner till smittort är det av epidemio¬logiska skäl därför mycket viktigt att detta anges då det påskyndar den epidemiologiska handläggningen, speciellt vid utbrott.

Typning görs idag primärt med serologisk teknik. Fullständig typning görs vid Smittskyddsinstitutet (SMI) och för veterinära isolat vid Statens Veterinärme¬dicinska Anstalt (SVA).

Motiverar smittspårningsarbetet ytterligare differentiering kan fagtypning och molekylärgenetisk metodik användas. Fagtypning av S. Typhimurium och S. Enteritidis utförs vid SMI. Även resistensmönstret är ofta till hjälp vid uppföljning av utbrott.

Kvalitetskontroll

Metodkalibrering förväntas ske på sätt som anges under avsnittet kvalitetssäkring i den allmänna delen.

Referensstammar

I tabell 9 listas de stammar som utgör referensstammar vid kontroll av substrat och övriga diagnostiska procedurer:

Svarsrutiner

Svar formuleras enligt laboratoriets traditioner. Följande bör därvid iakttas: Vid premiärisolering anges fynd av Salmonella species och att isolatet sänds till SMI för epidemiologisk typning (se nedan). Efter erhållet typningssvar meddelas detta till inremitterande med angivelse av serotypnamn. Ev. fagtyp behöver däremot inte anges. Vid senare positiva kontrollodlingar räcker det att svara växt av Salmonella-bakterier (utan angivande av serotypnamn). Resistensmönster anges endast på begäran från kliniken.