Bilaga 4. Virologiska metoder

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

---

VIROLOGISKA METODER

Bilaga 4.1

Bestämning av rotavirusantigen i feces med ELISA

ELISA-plattor: Costar EIA/RIA nummer 3590

Tvättbuffert: 0.9% NaCl + 0.05% Tween 20

Antikropp för coatning: Marsvin-antihuman rotavirus-serum (SMI)

Coatningsbuffert: 0.05M sodiumcarbonate, pH 9.5-9.7

Provmaterial: 10% feces-suspension i PBS

Spädningsbuffert: Trypsineringsbuffert med 0.5% BSA

Antikropp för detektion: Kanin-anti-human rotavirus (SMI)

Konjugat: Peroxidasmärkt get-antikanin IgG (Bio-Rad)

Substratbuffert: 0,1M Na-citrat-Hac-buffert pH 6.0 innehållande 0,002% H₂O₂

Substrat: Tetrametyhylbenzidin, TMB (ICN). TMB.stock; lösning 1% 3.3´,5.5´ tetramethylbenzidin upplöst i DMSO.

• Metod:
  • 1. Coata med 100 μL/brunn av marsvin-antihuman rotavirus-serum spätt 1/500 i coatningsbuffert. Inkubera över natt vid +4 °C eller 3 timmar vid +37 °C.
  • 2. Tvätta 4 gånger med tvättbuffert.
  • 3. Späd feces 1/10 i PBS – 0.05% BSA. Tillsätt i duplikat 100 μL/brunn. Inkubera 120 min vid 37 °C.
  • 4. Tvätta 4 gånger med tvättbuffert.
  • 5. Tillsätt 100 μL/brunn av kanin-anti-human rotavirus spätt 1/1000 i spädningsbuffert. Inkubera i 90 min vid 37 °C.
  • 6. Tvätta 4 gånger med tvättbuffert.
  • 7. Tillsätt 100 μL/brunn av peroxidasmärkt get-anti-kanin IgG spätt 1/50 000 i spädningsbuffert. Inkubera i 60 min vid +37 °C.
  • 8. Tvätta 6 gånger med tvättbuffert.
  • 9. Blanda substratlösningen strax innan användning: 100 μL TMB stocklösning i 10 mL substratbuffert. Tillsätt 100 μL/brunn även dör blankavläsning skall göras. Inkubera plattan i 5-10 min vid rumstemperatur.
  • 10. Reaktionen stoppas genom tillsats av 100 μL 2M H₂SO₄/brunn även där blankavläsning skall göras.
  • 11. Avläs vid 450 nm i en ELISA-spektrofotometer.

---

Bilaga 4.3

Metodbeskrivning för analys av adenovirus i feces med PCR-teknik

Faecesprovet blandas med vätska i transportröret/provtagningsröret (virus tran-sportmedium, PBS eller fysiologiskt koksalt) till en 10-20 % suspension och homogeniseras med vortex, gärna med tillsats av glaskulor. Provet överförs sedan till ett eppendorfrör och centrifugeras i 5 min. Has¬tigheten avgörs av provets sammansättning och man bör erhålla en överfas som går att pipettera. 200 µl av denna övervätska används sedan direkt för extraktion av adenovirus-DNA med hjälp av QIAamp Blood Mini Kit (QIAGEN) enligt medföljande Blood &Body Fluid Spin Protocol.

Arbetet bör ske i sterilbänk (skyddsklass 2) och speciella locköppnare kan användas till eppen¬dorfrören under extraktionen för att minimera risk för kontamination. Prov som innhåller de enteriska varianterna av adenovirus samt prov från immunosuppre¬merade patienter kan innehålla mycket stora kvantiteter av virus och kontamina¬tionsrisken kan i dessa fall betecknas som stor.

PCR-reaktionen sker i en totalvolym på 50 µl innehållande 10 µl QIAgen-extra-herat prov i 10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, pH 8,0 (20 °C), 200 µM av varje dNTP, 0,5 µM av vardera yttre primer eller 0,5 µM av vardera inre primer samt 1 U Taq DNA polymerase.

• PCR-program första amplifieringssteget:
  • 1. 95 °C 3 min 1 cykel
  • 2. 94 °C 30 s 55 °C 30 s 72 °C 1min 30cykler
  • 3. 72 °C 3 min 1 cykel

5 µl av amplifieringsprodukt från det första PCR-steget överförs till en ny identisk PCR-mix på 45 µl för nested PCR, dock nu med inre primers. Denna mix blandas på speciellt avgränsad yta endast avsedd för hantering av redan ampli-fierat material. OBS! PCR-röret från det första amplifieringssteget skall centri¬fu-geras för att avlägsna kondens innan det öppnas för överföring av amplifikat. Detta är mycket viktigt för att undvika eventuell kontaminering.

• PCR-program andra amplifieringssteget; nested PCR:
• 1. 94 °C 1 min 1 cykel
• 2. 94 °C 30 s 55 °C 30 s 72 °C 1min 30 cykler
• 3. 72 °C 3 min 1 cykel

Efter avslutad amplifiering analyseras 15 µl amplifieringsprodukt från både första och andra (nested) amplifieringsstegen tillsammans med 0,5 µg av en definierad molekylviktsstandard på en 2,0-2,5 % agarosegel av kvalitet med hög upplösning för gel-elektrofores. Varje prov och standarden blandas med 2,0 µl loadingbuffert innan separation på gel.Vid en spänning på 100V  30V beräknas en migrationstid på 3  1,5 tim för tillfredställande utvärdering av slutprodukt. Efter slutförd elektrofores infärgas agarosgelen med etidiumbromid (2 µg/ml) i 15 min  10 min. (PCR-produkter = 301bp respektive 171bp för enkel och nested PCR).

• Primersekvenser:
  • Hex1deg 5´-GCC (CG)CA (GA)TG G(GT)C (TA)TA CAT GCA CAT C-3´
  • Hex2deg 5´-CAG CAC (GC)CC ICG (AG)AT GTC AAA-3´

Ovanstående primers kombineras med följande primerpar i nested PCR.

• nestHex3deg 5´-GCC CG(CT) GC(AC) ACI GAI AC(GC) TAC TTC-3´
• nestHex4deg 5´-CC(CT) AC(AG) GCC AGI GT(AG) (AT)AI CG(AC) (AG)C(CT) TTG TA-3´

Referens

• Allard, A., B. Albinsson, and G. Wadell (2001). Rapid typing of human adenoviruses by a general PCR combined with restriction endonuclease analysis. J Clin Microbiol. 39:498-505