Legionella

Huvudartikel

---

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Nedre luftvägsinfektioner, 2:a upplagan 2005

och

till Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar med falldefinition i artikeln Legionellainfektion

---

Legionella

Smittämnen

Pneumoni orsakad av Legionella uppmärksammades första gången 1977 efter ett utbrott vid ”American Legion convention” på ett hotell i Philadelphia. Av deltagarna insjuknade 182 och mortaliteten var 16 % (Fraser och Mc Dade). Legionella tillhör gruppen gamma-proteobakterier och uppvisar vid sekvensering av 16S rDNA visst släktskap med Coxiella burnetii. Legionella är gramnegativa rörliga stavar som kan tillväxa mellan 20 ºC och ca 45 ºC samt överleva i högre temperaturer. Av de 48 arter som finns beskrivna har ett 20-tal visats orsaka infektion hos människa.

Arten Legionella pneumophila orsakar ca 80 – 90 % av legionellainfektionerna. Av övriga arter påträffas i Sverige främst L. bozmanii, L. longbeachae och L. micdadei. L. pneumophila kan på basen av ytliga polysackaridantigen delas upp i 15 serogrupper av vilka L. pneumophila serogrupp 1 svarar för majoriteten av infektionerna. Serogrupp 1 kan i sin tur subtypas med hjälp av monoklonala antikroppar (MAb) mot ytliga polysackaridantigen, vilket har varit till hjälp vid utredning av inträffade utbrott. Numera används i allt högre grad genotypning för att differentiera mellan olika stammar av legionella och för att påvisa identitet mellan isolat från patienter och från miljön.

Patogenes och patofysiologi

Med tiden har det blivit alltmer klart att samspel med frilevande protozoer i miljön är en viktig förutsättning för bakteriernas tillväxt. Med hjälp av särskilda virulensmekanismer har legionella förmåga till intracellullär växt i protozoer och >1000 bakterier kan finnas inuti en enda amöba innan den går i lys. Amöbacystor kan vidare innehålla vilande legionellabakterier, vilka senare kan aktiveras vid cystans omvandling till trofozoit. Eftersom protozoer och deras cystor tål uttorkning och höga halter av biocider kan bakterierna därför under ogynnsamma omständigheter lättare överleva inuti. Mekanismerna för legionellainfektion hos protozoer tycks vara de samma som vid infektion av mänskliga makrofager. Flera virulensfaktorer spelar sannolikt en roll för intracellullär växt. En viktig känd faktor är mip-proteinet (macrophage infectivity potentiator), som finns på cellytan. LPS spelar sannolikt också en roll. En annan viktig känd faktor är typ IV- sekretion reglerad genom dot/icm-genkomplexet.

Möjligen kan virulenta L. pneumophila serogrupp 1 överleva bättre i aerosoler än icke virulenta. Misstanke finns att den intracellullära förekomsten i protozoer är viktig för uppkomsten av själva infektionen vid smittotillfället. En amöba eller dess fagosomer kan uppträda som infektiösa paket med ett stort innehåll av bakterier. Sannolikt är då också legionellabakteriernas virulens aktiverad. Om jämförelsevis låga halter av infekterade amöbor finns i vattnet kan det förklara varför anslagsfrekvensen för legionellapneumoni är låg trots att bakterierna odlas fram från vattensystemet. Med hjälp av tillsatta protozoer kan man öka känsligheten för påvisning av legionella i miljöprov. Denna metod är dock resurskrävande och används därför sällan. Även med immunfluorescens har icke odlingsbara legionellabakterier kunnat påvisas i vatten. Legionella smittar från miljön men ej från människa till människa. Smittkällan är vanligen vatten.

Bakterierna når lungorna främst genom inhalation av aerosoler. Aspiration har angetts vara viktig vid vårdrelaterad legionellos. Rökning ökar mottagligheten för legionellainfektion eftersom respirationsepitelets ciliefunktion utgör en skyddsmekanism. Andra känsliga patientgrupper är patienter med kronisk obstruktiv lungfunktion samt etyliker som också uppvisar nedsatt mukociliär clearancefunktion. Legionella har förmåga att adherera till respiratoriskt epitel via fimbrier. Efter att bakterierna nått lungorna beror utgången på samspelet mellan bakteriens virulens och värdens immunförsvar.

Alveolarmakrofagerna utgör en kritisk del i försvaret. Bakterierna fagocyteras och inkorporeras i en specialiserad fagosom. Fusion mellan fagosom och lysosom sker ej initialt som förväntat. Bakterierna förvärvar förmåga att motstå de lysosomala enzymerna och kan därefter utnyttja tillgängliga lysosomala aminosyror för sin tillväxt. Till sist ruptureras makrofagerna. Det fullständiga värdförsvaret vid legionellainfektion är ej helt klarlagt. Det humorala immunförsvaret spelar sannolikt endast en sekundär roll. Cellmedierad immunitet förefaller viktig eftersom legionärsjuka är vanligare och svårare hos patienter med nedsatt cellmedierad immunitet t.ex. transplanterade patienter, patienter som kortisonbehandlas samt AIDS-patienter.

Symtom och klinisk bild

I princip kan legionellaexposition ge upphov till legionärsjuka, Pontiac-feber (icke-pneumonisk legionellos) eller asymtomatisk infektion.

Legionärsjuka definieras som pneumoni orsakad av bakterier tillhörande genus Legionella. Symtombilden är ofta allvarlig med utbredda lunginfiltrat och påverkat allmäntillstånd. Vid progress kan multiorgansvikt uppträda. Inget enskilt symtom är dock prediktivt för legionellainfektion och den kliniska bilden kan även vara mild. Inkubationstiden varierar mellan 2-10 dagar, men kan vara upp till 3 veckor.

Sjukdomen debuterar vanligen med mild och i typiska fall sparsamt produktiv hosta (dock producerar färre än 50 % av patienterna sputa). Blodtingerade sputa kan förekomma medan hemoptys är ovanligt. Diarré förekommer hos 25-50 %. Illamående, kräkningar och buksmärta förekommer hos 10-20 %. Neurologiska symtom varierar från huvudvärk till encefalopati. Lungröntgen visar typiskt multifokal pneumoni men ibland ses lobär pneumoni. Kaverner kan ses vid immunbristtillstånd och vid pågående steroidbehandling. Mortaliteten är hög vid pneumoni, särskilt hos immunsupprimerade patienter. Känsliga personer är t.ex. personer med nedsatta respiratoriska reflexer; könsskillnader finns också med kraftig övervikt av infektioner hos män.

Pontiac-feber är en självläkande akut influensaliknande sjukdom utan pneumoni. Inkubationstid är 24 – 48 timmar. Anslagsfrekvensen är till skillnad från legionellapneumoni hög. Symtomen är trötthet, muskelvärk, huvudvärk, feber och frossa. Icke-produktiv hosta och illamående kan förekomma. Lungröntgenbilden är opåverkad. Endast symtomatisk behandling behövs och vanligen är man helt återställd inom en vecka. Vid Pontiac-feber kan legionellabakterier inte påvisas med odling. PCR kan vara ett ännu ej fullt utvärderat alternativ. Diagnosen måste därför ställas med serologisk metodik. Arter andra än Legionella pneumophila serogrupp 1 förekommer oftare jämfört med legionellapneumoni.

Remiss, provtagning och transport

Önskemål om legionellaodling bör alltid anges på remissen. För epidemiologisk utredning samt nationell och internationell rapportering är det värdefullt att på remissen ange uppgift om ev. immunsuppression, utlandsvistelse, misstänkt nosokomial smitta, misstänkt smittkälla, förutom sedvanliga uppgifter om insjuknings- och provtagningsdatum samt antibiotikabehandling. Legionella-bakterierna är inte särskilt känsliga för långa transporttider men snabb transport till laboratoriet är ändå viktig med tanke på risken för överväxt av ovidkommande bakterier. Närvaron av NaCl i BAL-vätska under transport till laboratoriet påverkar inte odlingsresultatet. Provtagning i övrigt beskrivs under respektive provtyp.

Laboratoriediagnostik av legionellos

Allmänt

Pneumonisjukdom kan diagnostiseras med odling, antigenpåvisning (direkt mikroskopi på luftvägssekret med FITC-märkta specifika antisera alternativt påvisning av Legionella-antigen i urin), påvisning av specifika DNA-sekvenser genom amplifiering eller antikroppspåvisning (serologi). Eftersom känsligheten ej är optimal i någon av dessa test kan det vara nödvändigt att kombinera flera för att få en infektionsdiagnos. Mindre än hälften av alla patienter med legionellainfektion producerar sputum. Ca 25 % av legionellapneumonier kan sakna serologiskt svar.

Referensmetod för Legionella spp är odling. Positiv odling innebär hög diagnostisk specificitet för pågående legionellainfektion. Odling kan göras från upphostat material (sputum), bronkoalveolär lavagevätska (BAL-vätska), borstprov och uppsuget bronk- eller trakealsekret. Odling från BAL-vätska är känsligare än från borste och bör därför prioriteras. Även s.k. dåliga sputumprov, som är salivtillblandade, kan odlas för legionella och bör alltså inte kasseras. Problem i samband med utodling är risk för överväxt av ovidkommande flora samtidigt som legionellabakterierna förekommer i lågt antal. I förekommande fall kan det vara lämpligt att odla från pleuravätska liksom från lungvävnad. Blododling har i studier där man använt särskilda medier blivit positiv i 25 – 30 %, men dessa medier finns i regel inte att tillgå. De blododlingsmedier som används för odling av vanliga bakterier har inte rätt sammansättning för att legionellabakterier skall växa. Nasofarynxprov lämpar sig inte för legionellaodling.

Odling bör alltid utföras vid misstanke om legionellapneumoni eftersom det är den enda metoden som täcker in samtliga legionellaarter och som ger möjlighet till en förhållandevis snabb diagnos. Eftersom legionellainfektion föranleder utredning med påföljd att man vill jämföra patientisolat med miljöisolat är det också viktigt att säkra bakterieisolat från patienten.

• Prestanda: Korrekt utförd odling har fördel av maximal specificitet och förhållandevis hög sensitivitet (0,7 – 0,9). Resultatet påverkas dock av odlingsförfarandet, odlingsmediernas kvalitet och provtagningsmetodiken.

Referensmetodik

a) Odling

Odling är referensmetod för påvisning av Legionella spp.

Referenssubstrat

Legionella-bakterier kan inte metabolisera kolhydrater och växer därför inte på vanliga odlingsmedier. För odling används ett särskilt medium (Buffered charcoal yeast extract, BCYE, se bilaga 1.2.4) som bl.a. innehåller tillsats av aktivt kol (eftersom bakterierna är känsliga för substanser i miljön), järn (högt krav på järn), cystein (absolut krav på cystein) och alfaketoglutarsyra. Substratet saknar också NaCl eftersom salt hämmar bakterieväxten. Varianter med tillsats av selektiva antibiotika (vankomycin, polymyxin) bör användas, eftersom luftvägsflora och annan tillfällig flora hämmar utväxten av legionella. Provet bör också som regel förbehandlas med syra och/eller värme för att minska påverkan från ovidkommande bakterieflora, Obs! Provet skall inte tvättas! Odlingarna bör inkuberas under ca 10 dagar men preliminärt svar kan oftast levereras inom 3 till 5 dagar. Viktigt är att mediet håller rätt pH (pH 6,85-6,95) och inte har oxiderat.

Isolering

Prov med risk för stor tillblandning av ovidkommande normalflora t.ex. sputum, eller i övrigt purulent provmaterial och vävnad behandlas med syra eller uppvärmning. Övriga prov förbehandlas normalt inte. Vid eventuell växt av gramnegativa stavar i riklig mängd på hematinagarplattan efter ett dygn, syrabehandlas provet och odlas därefter ut igen. Det är också viktigt att i samband med utodling odla även från spätt prov eftersom inhiberande faktorer kan förekomma i provmaterialet.

Syrabehandling

• Sputolysinbehandlat prov blandas 1:10 med KCL-HCL, pH 2,2,
  • KCL-HCL 0,2 mol/L
  • KCL 14,91 g
  • Dest. Vatten ad 1000 mL

Justera pH med 1 M HCL, använd inte någon Na-förening. Autoklavera vid 120 °C i 20 min.

• låt stå i rumstemperatur i max 4 min, viktigt att tiden inte överskrids.
• utodlas enligt nedan.

Applicera med 10 µl ögla (blå) eller pasteurpipett två droppar provmaterial på BCYEα, MWY-medium (bilaga 1.2.4) och hematinagarplatta. Från den ena droppen görs utstryk med ögla, medan den andra droppen får torka in. Legionella behöver ibland koncentrerat provmaterial, ibland en utspädningseffekt för att växa.

Odlingsplattorna inkuberas vid 35-37 °C i vanlig atmosfär och i plastpåsar för att motverka uttorkning Avläsning sker dagligen under plattmikroskop med snett uppifrån påfallande ljus, negativa prov kan preliminärsvaras efter 5 dygn och slutsvaras efter 10 dygn. Det tar vanligen 2 dygn för mikroskopiska kolonier att växa ut och 3 dygn för makroskopisk växt.

Identifiering och minimikriterier

Kolonierna är blåvita eller rosa, välvda med jämn kant. Obs! plattmikroskop skall användas vid avläsning. Unga kolonier är 1-2 mm i diameter och krackelerade, råglasliknande, vilket dock försvinner efter några dygn då de också tenderar att plattas ut och få ett hopsjunket centrum, samtidigt som diametern ökar. Det råglasliknande koloniutseendet kan ibland kvarstå i periferin på äldre kolonier. Makroskopiskt synliga kolonier efter ett dygn är vanligtvis inte Legionella. Man har då nytta av att jämföra med hematinagarplattan, där de flesta bakterier från luftvägarna växer.

Bakterierna är små, pleomorfa gramnegativa stavar, cysteinkrävande, d.v.s. de växer på BCYE men inte på blodagar.

• Nivå 1: misstänkta isolat verifieras genom renstrykning på BCYE, BYE (plattor utan cystein) och blodagar. 2 preparat läggs, ett för gramfärgning och ett för immunfluorescens (IF). Legionella är katalaspositiv (vissa arter dock med svag reaktion). L. pneumophila och några andra arter är (ofta svagt) oxidaspositiva. IF utförs med monoklonalt antikroppsreagens riktat mot samtliga serogrupper av L. pneumophila.
• Nivå 2: isolatet skickas till hänvisningslaboratorium för identifiering. Hänvisningslaboratoriet kan verifiera ovanliga Legionella-arter i första hand med utvidgad serologisk panel.

Kvalitetskontroll

• Referensstammar
  • a) för substratkontroll och minimikriterier
  • L. pneumophila serogrupp 1 CCUG 9568 (ATCC 33152),
  • L. micdadei CCUG 31229A.

Svarsutiner

Negativ odling kan preliminärsvaras efter 5 dygn och slutsvaras efter 10 dygn. Växt av Legionella meddelas per telefon, skriftligt svar med artbestämning kan skickas ut inom 3-9 dagar.

b) Påvisning av legionellaantigen i urin

Metoden är referensmetod för påvisande av L. pneumophila serogrupp 1 (se bilaga 4.5).

Polysackarider från legionellabakteriernas cellvägg utsöndras i urinen under det akuta skedet av en pneumoni och kan påvisas med enzymimmunologiska metoder. Antigenförekomst i urin kan analyseras med EIA- eller immunkromatografisk teknik. Detta snabbtest är avsett för L. pneumophila serogrupp 1. Provet kan utföras snabbt och bör därför alltid ingå vid misstanke om legionellos. Obs! Infektioner orsakade av andra legionellaarter och andra serogrupper av L. pneumophila än serogrupp 1 kan f.n. inte diagnostiseras, vilket också är en viktig anledning till att odling utförs. Urinprov tagna i ett mycket tidigt skede efter symtomdebuten (< 5 dygn) kan bli negativa varför provtagningen i dessa fall bör upprepas vid negativt resultat. Prestanda: Sensitiviteten vid infektioner med L. pneumophila serogrupp 1 är 0,6 – 0,9, specificiteten nära 1,0.

Kvalitetssäkring

Nationella eller internationella kalibratorer saknas. Tillverkaroberoende kontroll (positivt patientprov), europeiskt kvalitetssäkringsprogram, EWGLI.

c) Serologi

Indirekt immunfluorescens (IF)

Parad serologi tillsammans med odling och u-antigen kan betraktas som referensmetod för påvisande av infektion med L. pneumophila, men kan vid positivt utfall för andra Legionella spp ge presumptiv diagnos. Endast 4-faldig titerändring talar för säker aktuell legionellainfektion. Singelserumdiagnostik med enstaka höga titrar kan ge viss vägledning men brist på utvärderade referenspopulationer gör tolkningen osäker. Endast serologi för L. Pneumophila serogrupp1 är nöjaktigt utvärderad. Se vidare bilaga 4.4.

Alternativa diagnostiska metoder

Antigendetektion med fluorescensmärkta specifika antikroppar (DFA)

Immunfluorescens utförs på provmaterial från de nedre luftvägarna och på vävnad. Används framför allt som snabbtest i akuta situationer vid svår pneumoni. Eftersom metoden kräver stor erfarenhet vid avläsning och ändå vidlåds av en låg sensitivitet har många laboratorier ersatt den med påvisning av antigen i urin. Dock, i vissa situationer som vid undersökning av fixerat vävnadsmaterial kan immunfluorescens vara det enda alternativet som står till buds.

• Prestanda: Specificiteten är hög för L. pneumophila vid användning av FITC-konjugerade monoklonala antikroppar men sensitiviteten samtidigt låg (ca 50 %). Andra legionellabakterier än L. pneumophila diagnostiseras inte med gängse reagens.

Detektion av specifikt DNA

Påvisning av DNA från Legionella kan göras genom amplifiering av specifika nukleinsyrasekvenser i provmaterialet, t.ex. med polymeraskedjereaktion (PCR). Mindre arbetskrävande PCR-metoder är under utarbetande framför allt realtids-PCR. Mest validerade metoder är metoder som påvisar mip-gener eller gener kodande för rRNA.

PCR utförs lämpligen samtidigt och på samma material som skickats för odling. PCR utförs ännu endast på några få laboratorier. Metoden har hög känslighet och specificitet och har visat sig särskilt värdefull när patienterna har hunnit bli antibiotikabehandlade. Användning av PCR på andra provmaterial som serum och urin har rapporterats men är ännu otillräckligt utvärderade. Positiv PCR, anses endast ge en presumptiv legionelladiagnos.

Resistensbestämning och resistensutveckling

Resistensbestämning utförs ej eftersom legionellaarterna vid olika studier uppvisat en stabil känslighet för vanligen givna antibiotika, t.ex. erytromycin och ciprofloxacin. Vid behov kan en bedömning av känsligheten göras med Etest. Det är sannolikt en fördel att samla erfarenheten av sådan känslighetsbestämning vid ett fåtal laboratorier. Sådana prover tas emot vid hänvisningslaboratoriet vid UAS.

Legionellabakterier har god känslighet för makrolider, azalider och kinoloner liksom för rifampicin. Känslighet saknas för många betalaktamantibiotika (penicilliner och cefalosporiner) på grund av betalaktamasbildning. In vitro är imipenem och aminoglykosider verksamma men kliniskt saknar dessa substanser effekt eftersom de inte penetrerar intracellullärt, vilket är en förutsättning. Förmågan till resistensutveckling är relativt lite utredd, samtidigt som den kliniska effekten i hög grad påverkas av antibiotikas farmakokinetik i det intracellullära rummet. Nya makrolider och kinoloner visar sig ha bättre effekt än erytromycin och ciprofloxacin, t.ex. azitromycin och levofloxacin/moxifloxacin.

Epidemiologisk typning

Vid försök att kartlägga utbrott av legionellainfektion och att finna smittkällan är det nödvändigt att kunna jämföra bakterieisolat från olika patienter med varandra och med isolat från miljön. Med monoklonala antikroppar mot polysackaridantigen på cellväggens yta kan man erhålla en profil som ger möjlighet att dela upp L. pneumophila serogrupp 1 i olika subtyper som oftast har namn efter en ort, t.ex. Bellingham, Benidorm, Knoxville, Oxford, Philadelphia. Denna metod är emellertid otillräckligt diskriminerande och numera använder man mest olika genmetoder som baserar sig på PFGE. En del metoder använder sig av en PCR för anrikning av DNA-fragment före elektroforesen. Efter en genomförd gelelektrofores kan man jämföra bakterieisolatens mönster med hänsyn till antalet fragmentband och deras inbördes läge. Resultatet blir ett slags ”fingeravtryck” för respektive bakteriestam.

Epidemiologisk typning utförs vid referenslaboratoriet (klin. Mikrobiologiska laboratoriet, Akademiska sjukhuset, 751 85 Uppsala).

EWGLI har skapat en kollektion av genotypiskt definierade stammar (AFLP) som är tillgängliga via nätet (www.ewgli.org). För närvarande pågår arbete inom ramen för EWGLI att standardisera en typning baserad på sekvensering av flera gener, sequence based typing (SBT). Denna form av genotypning kommer framledes sannolikt att bli standardmetod.

Laboratorierapportering

Legionellainfektion är anmälningspliktig enligt smittskyddslagen, övrig anmälningspliktig sjukdom.

Kriterier för legionellos

Som säkerställd legionellainfektion räknas fall med positiv legionellaodling, signifikant 4-faldig titerförändring (L. pneumophila) och/eller positivt test för legionellaantigen i urin (L. pneumophila serogrupp 1) (Edelstein 1993).

REFERENSER

Fields BS, Benson RF, Besser RE. 2002. Legionella and Legionnaire´s Disease: 25 years of investigation. Clin Microbiol Rev. 15:506-26.

Edelstein PH. 1993. Legionnaires` Disease. Clin Infect Dis 16: 741-9. Bernander S, Kallings I, Nordström K. 1990. Legionellainfektioner diagnostiserade i sluten vård i Västmanland. Läkartidningen. 87: 4429-31.

Benin AL, Benson RF, Besser RE. 2002. Trends in Legionnaire´s Disease, 1980-1998: declining mortality and new patterns of diagnosis. Clin Infect Dis. 35:1039-46.

Helbig JH, Bernander S, Castellani Pastoris M, Etienne J, Gaia V, et al. 2002. Pan-European study on the culture-proven Legionnaire´s Disease: Distribution of Legionella pneumophila serogroups and monoclonal subgroups. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 21:710-716.

Bernander S, Kallings I. 1998. Parasit hos människa och amöba: Sänkt varmvattentemperatur gynnar legionellabakterierna. Läkartidningen. 95: 4340-44.

Cirillo JD, Cirillo SLG, Yan L, Bermudez LE, Falkow S, Tompkins LS. 1999. Intracellullar growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67: 4427 – 4434.

Edelstein PH. 1998. Antimicrobial chemotherapy for Legionnaires´ Disease: Time for a change. Annals of Internal Medicine. 129: 328- 330.

Plouffe JF, File TM, Breiman RF, Hackman BA, Salstrom SJ, Marston BJ, Fields BS, and the Community Based Pneumonia Incidence Study Group. 1995. Reevaluation of the definition of Legionnaires´ disease: Use of of the urinary antigen assay. Clin. Infect. Dis. 20: 1286 – 1291.

Bernander S, Hanson H-S, Johansson B, Stedingk L-V. 1997. A nested polymerase chain reaction for detection of Legionella pneumophila in clinical specimens. Clinical Microbiol. Infect. 3: 95 – 101.

Fraser DW, Tsai T, Orenstein W, Parkin WE, Beecham HJ et al. 1977. Legionnaires’ disease: description of an epidemic pneumonia. N Engl J Med. 297: 1183-1197.

McDade JE, Shepard CC, Fraser DW, Tsai TR, Redus MA et al. 1977. Legionnaires’ disease: Isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. N Engl J Med. 297: 1197-1203.

Helbig JH, Kurtz JB, Castellani Pastoris M, Pelaz C, Lück PC. 1997. Antigenic polysacharide components of Legionella pneumophila recognized by monoclonal antibodies: possibilities and limitations for division of the species into serogroups. J Clin Microbiol. 35: 2841-2845.

Darelid. J. Epidemiology and long term control of Nosokomial Legionnaires’ Disease. MD Thesis. Faculty of health sciences, Linköping University, Sweden. 2003.

Bernander S. Detection and epidemiologic subtyping of Legionella pneumophila using DNA-based molecular methods. MD Thesis, Karolinska Institute, Stockholm, Sweden. 2003.