3. Referenssubstrat-svamp

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Svampinfektioner

---

Referenssubstrat-Svampdiagnostik

Inom mykologin används ett stort antal olika substrat för att optimalt isolera och identifiera olika jästsvampar, dermatofyter, övriga mögel och dimorfa svampar. De här angivna substraten utgör ett basalt urval men behöver ej ses som en bindande rekommendation. Varje svamplaboratorium har sina behov och kan föredra andra substrat. Recepten bifogas för att på ett enkelt sätt vara tillgängliga och för att underlätta en standardisering inom landet. De flesta substraten finns beskrivna i Difco Manual.

Hållbarhet för medier, allmänt

• Plattor 4 veckor i förseglad plast
• Rör med plasthatt 3 mån
• Skruvlocksrör 6 mån

Arbutinagar

Indikation

• Diagnostik av jästsvamp

Princip

• Differentierande medium:
• Mörkbrun utfällning bildas runt svampen i substratet beroende på att arbutin hydrolyseras.

Medium/Substrat Arbutinagarbas 200 mL

• Ingående komponenter:
  • Arbutin ----- 1 g
  • Agar No 1, Oxoid L 11 ----- 2,2 g
  • Jästextrakt, Difco 0127 ----- 1,4 g
  • Ultrarent vatten ----- 200 mL
  • Järn(III)klorid, 10 %, sterilf. 1,3 mL

Beredning

• 1. Smält basagarn och temperera den till ca 50 °C.

• 2. Tillsätt järnkloridlösningen.
• 3. Gjut agarplattor, ca 20 mL per skål.

Assimilationsagar

Indikation

• Artbestämning av jästsvamp (kolhydratassimilation).

Princip

• Differentierande medium: Mediet saknar kol- och energikälla i tillräcklig koncentration för att ge synlig växt. Tillförsel av olika sockerarter kan fungera som kol- och energikälla, olika för olika sockerarter. Växten upptäcks lättare genom att sura produkter bildas, vilket ändrar pH-indikatorns färg till gul.

Medium/Substrat Kaliumdivätefosfat, KH₂PO₄, p.a. 1 g

• Ingående komponenter:
  • Magnesiumsulfat, MgSO₄ x 7 H₂O, p.a.----- 0,5 g
  • Ammoniumsulfat, (NH₄)₂SO₄, p.a.----- 5 g
  • Agar ----- 15 g
  • Bromkresolpurpur ----- 0,05 g
  • 1 mol/L NaOH, nyberedd ----- 0,05 mL
  • Ultrarent vatten ----- 1000 mL

pH 6,6 + 0,1 vid 25 °C

Beredning

• 1. Blanda ingredienserna med vattnet i kolv.

• 2. Lös under omskakning.
• 3. Autoklavera 15 min vid 121 °C.

Brain Heart Infusion (BHI)-agar

Indikation

• Svampodling

Princip

• Antibiotika för hämning av bakterier tillsätts efter behov. Blod (5 %) kan tillsättas för dimorfa svampar med högre näringskrav än ordinära svampar.

Medium/Substrat

• Brain Heart Infusion Agar, Difco ----- 26 g
• Dest. vatten ultrarent ----- 500 mL

pH 7,4 ± 0,2

• Ingående komponenter:
  • “Calf brains infusion” ----- 200 g
  • “Beef Heart infusion” ----- 250 g
  • Proteospepton ----- 10 g
  • Glukos ----- 2 g
  • Natriumklorid ----- 5 g
  • Dinatriumvätefosfat ----- 2,5 g
  • Bacto Agar ----- 15 g

Beredning

• 1. Lös med hjälp av värme

• 2. Autoklavera 120 °C i 20 min
• 3. Låt svalna till 50 °C

Brom Cresol Purpur Casein Glucose (BCPCG)-agar

Indikation

• Artbestämning av dermatofyter

Princip

• 1) pH-förhöjning ändrar substratfärgen från gråblå till lila

• 2) hydrolys av kasein ger uppklarning

• 3) arttypiskt koloniutseende hos dermatofyter

• 1.
  • Destillerat vatten ----- 500 mL
  • Skummjölkspulver ----- 40 g
  • Bromkresolpurpur, löst i 1,6 % etanol ----- 1 mL

• 2.
  • Destillerat vatten ----- 100 mL
  • Glukos ----- 20 g
  • Kloramfenikol ----- 50 mg/L
  • Gentamicin ----- 20 mg/L

• 3.
  • Destillerat vatten ----- 400 mL
  • Difco agar ----- 15 g

Beredning

• 1 och 3 autoklaveras separat och blandas
• 2 sterilfiltreras

pH Justeras till exakt 6,8

Chromagar

Indikation

• Isolering och differentiering av jästsvampar.

Princip

• Differentierande medium. Speciesspecifikt kromogent substrat (se Tabell 10).

Medium/Substrat CHROM-agar (CHROMagar Comp Paris; ILS Lab, Sverige) 47,5 g

• Ingående komponenter:
  • Agar ----- 15 g
  • Pepton ----- 10 g
  • Kromogen blandning ----- 22 g
  • Kloramfenikol----- 0,5 g

• • Ultrarent vatten ----- 1000 mL

pH 6,3

Beredning

• 1. Blanda pulver och vatten i kolv och lös under långsam omrörning medan agarn sväller.
• 2. Uppvärm till kokning. Omrörning och kokning igen flera gånger tills allt löst sig.
• 3. Autoklavera 15 min vid 121 °C
• 4. Efter autoklaveringen, temperera agarlösningen till ca 50 °C.
• 5. Gjut agarplattor, ca 20 mL per skål.

Corn meal agar (Majsmjölagar)

Indikation

• För identifiering av mikromorfologi hos jästsvamp (se Tabell 10). Rött pigment hos Trichophyton rubrum.

Princip

• Mediet är huvudsakligen tillverkat av infusion från mald gul majs. Tween 80 (en oljesyraester) sänker ytspänningen och

ökar klamydokonidiebildningen hos Candida albicans. Bildning av pseudohyfer och hyfer i artkarakteristiska formationer.

Medium/Substrat Corn Meal Agar, Difco 0386 17 g

• Ingående komponenter:
  • Infusion från majsmjöl ----- 50 g
  • Agar ----- 15 g

• • Tween 80 -----10 mL
  • Glukos (endast vid dermatofytdiagnostik för pigmentbildning hos T. rubrum)----- 10 g
  • Ultrarent vatten ----- 1000 mL

pH 5,6 + 0,2 vid 25 °C

Beredning

• 1. Blanda ingredienserna med vattnet i kolven.
• 2. Lös genom omskakning och kokning.
• 3. Autoklavera 15 min vid 121 °C

Dermatofyt test medium (DTM)

Indikation

• För isolering och diagnostik av dermatofyter. (C. albicans växer).

Princip

• Sojapeptonet är en näringskälla och glukos en energikälla. pH-indikatorn fenolrött används för att påvisa alkaliska produkter som bildats vid deaminering av aminosyror, varvid substratet ändrar färg från orange till rött. Cykloheximid hämmar saprofytiska svampar och några få patogena arter såsom Aspergillus och Fusarium. Kloramfenikol är ett bredspektrumantibiotikum som

hämmar många grampositiva och gramnegativa bakterier. Dermatofyter är inte känsliga för dessa antibiotika.

Medium/Substrat Mycosel Agar, BBL 11462 36 g

• Ingående komponenter
  • Sojabönsmjöl, papainbehandlat----- 10 g
  • Glukos----- 10 g
  • Agar ----- 15,5 g
  • Cykloheximid ----- 0,4 g
  • Kloramfenikol----- 0,05 g
  • Ultrarent vatten ----- 1000 mL
  • Fenolrött, 0,5 % ----- 40 mL
  • Gentamicinsulfat (löst i 2 mL ultrarent vatten) ----- 0,1 g

pH 5,5 + 0,2 vid 25 °C

Beredning

• 1. Lös under omskakning och kokning.
• 2. Tillsätt gentamicin (aktiviteten bör ha kontrollerats).
• 3. Autoklavera 7 min vid 121 °C.

Glukosblodagar

Indikation

• För odling av framför allt jästsvamp

Princip

• Rikt allmänt medium: Peptonerna tillför aminosyror och jästextraktet förser mediet med vitaminer, främst från B-gruppen. Tillsats av hästblod ger ytterligare tillväxtsubstanser. Glukostillsatsen är en lättillgänglig kol- och energikälla.

Medium/Substrat Columbia II Agar Base, BBL 97596 360 g

• Ingående komponenter (g/L)
  • Kasein, nedbrutet med pankreasenzymer ----- 11,5 g
  • Djurvävnad, behandlad med pepsin ----- 5,0 g
  • Jästextrakt ----- 3,5 g
  • Hjärtmuskel, behandlad med pankreasenzymer ----- 3,0 g
  • Majsstärkelse ----- 1,0 g
  • Natriumklorid ----- 5,0 g
  • Agar ----- 13,5 g
  • Glukos ----- 180 g
  • Ultrarent vatten ----- 9000 mL
  • Hästblod, citratbehandlat ----- 600 mL

pH 7,3 ± 0,2

Beredning

• 1. Blanda agarpulver, glukos och vatten i kastrullen och häll blandningen i mediaberedaren
• 2. Autoklavera 15 min vid 121°C
• 3. Efter autoklavering temperera agarlösningen till ca 50 °C och tillsätt hästblod
• 4. Vankomycin till 10 mg/L samt kloramfenikol till 0,5 mg/L
• 5. Gjut agarplattor, ca 25 mL per skål

Glukosbuljong för anrikning av svamp

Indikation

• Anrikningsmedium för bl.a. kryptokocker i likvor.

Princip

• Köttextrakt och pepton innehåller kväve; glukos är en kol- och energikälla. Natriumklorid tillför mediet salt.

Medium/Substrat Nutrient Broth No 2, Oxoid CM 67 25 g

• Ingående komponenter
  • ´Lab Lemco´ pulver ----- 10,0 g
  • Pepton ----- 10,0 g
  • Natriumklorid ----- 5,0 g
  • Glukos ----- 10 g
  • Ultrarent vatten ----- 1000 mL

pH 7,5 + 0,2 vid 25 °C

Beredning

• 1. Blanda ingredienserna med vattnet i kolven.
• 2. Lös under omrörning.
• 3. Autoklavera 15 min vid 121 °C

Fågelfröagar

Indikation

• Speciesdiagnostik av Cryptococcus neoformans.

Princip

• Selektivt och differentierande medium: C. neoformans har förmåga att bilda fenoloxidas, vilket avslöjas som brunpigmentering av kolonierna.

Medium/Substrat Agar, Difco 15 g

• Ingående komponenter
  • Glukos ----- 1 g
  • Kreatinin ----- 1 g
  • Kaliumdivätefosfat, KH₂PO₄, p.a.----- 1 g
  • Fågelfrö, Guizotia abyssinica frö ----- 50 g
  • Kloramfenikol----- 1 g
  • Ultrarent vatten ----- 1000 mL

Beredning

• 1. Pulvrisera fågelfröna i mortel med 100 mL vatten
• 2. Häll dem i kolv tillsammans med 1000 mL vatten och koka i ca 30 min
• 3. Filtrera genom gasväv och mät upp volymen av extraktet till 1000 mL med vatten
• 4. Tillsätt övriga ingredienser till filtratet och lös dem genom kokning
• 5. Autoklavera 15 min vid 121 °C

Efter autoklavering:

• 6. Efter avsvalning till ca 50 °C tillsättes kloramfenikol, som är löst i 5 mL alkohol

Jäsningsmedium för svamp med glukos m. fl. sockerarter

Indikation

• Artbestämning av jästsvamp (se Tabell 10)

Princip

• Differentierande medium: Jäsning av glukos, galaktos, sackaros, maltos, laktos, trehalos, raffinos.
• Jäsning, med synlig gasbildning. Vid gasbildning samlas denna upp i det inre upp- och nervända durhamröret.

Medium/ Substrat Basbuljong

• Ingående komponenter
  • Jästextrakt, Difco 0127 ----- 14 g
  • Ultrarent vatten ----- 2800 mL
  • Glukos ----- 8 g/400 mL

pH 6,6 + 0,2 vid ca 25 °C

Beredning

• 1. Blanda jästextrakt och vatten i kolven.
• 2. Lös under omrörning.
• 3. Sätt 400 mL till 7 st kolvar.
• 4. Tillsätt glukos till 1 kolv innehållande 400 mL
• 5. Spara de övriga portionerna till resterande sockerarter.
• 6. Dispensera 3 mL/rör. Använd dispenseringsapparat.
• 7. Autoklavera 30 min 100 °C (strömmande ånga) 2 dagar i följd.

Kanavaninagar

Indikation

• Differentiering av serotyper av Cryptococcus neoformans.

Princip

• Differentierande medium: Aminosyran kanavanin (basisk) samt pH-indikatorn bromtymolblått är tillsatta i mediet. Kanavanin fungerar som substrat för C. neoformans, varvid basiska produkter bildas, vilket höjer pH och mediet blir blått vid serotyp B,C.

Medium/Substrat Basagar

• Ingående komponenter
  • Agar, Difco 0140 ----- 2 g
  • Bromtymolblått ----- 4 mL
  • Ultrarent vatten ----- 86 mL

• Färdigt medium:
  • Basagar, autoklaverad, flytande ----- 90 mL
  • Kanavaninlösning, sterilfiltrerad ----- 10 mL

• Ingående komponenter
  • Kaliumdivätefosfat ----- 10 g
  • Magnesiumsulfat ----- 10 g
  • Glycin ----- 100 g
  • Tiaminhydroklorid ----- 0,01 g
  • L-kanavanin ------ 0,3 g

pH 5,6 + 0,2 vid 25 °C

Beredning av Basagar

• 1. Blanda agar och vatten i kolv och lös under omskakning och kokning
• 2. Tillsätt bromtymolblått och skaka om.
• 3. Autoklavera 15 min vid 121 °C

Efter autoklavering

• 4. Efter autoklavering och då mediet tempererats till ca 50 °C tillsättes den likaledes tempererade kanavaninlösningen. Arbeta sterilt i sterilbänk.

Kaseinagar, vitaminfri och med tillsats av inositol och tiamin

Indikation

• Testa dermatofyters vitaminberoende

Princip

• Vitaminförsök.

Medium/Substrat

• Ingående komponenter
  • Vitaminfritt kaseinhydrolysat, Difco ----- 1,25 g
  • Kaliumdivätefosfat, KH₂PO₄, p.a. ----- 0,9 g
  • Magnesiumsulfat, MgSO₄ x 7 H₂O, p.a.----- 0,1 g
  • Glukos ----- 20 g
  • Agar, Difco 0140 ----- 10 g
  • Ultrarent vatten ----- 500 mL

Beredning

• 1. Blanda ingredienserna med vattnet i kolv.
• 2. Lös under omskakning och uppkokning. Kontrollera att mediet inte fastnar på kolvens botten under uppvärmningen.
• 3. Autoklavera 15 min vid +121 °C.
• 4. Dela satsen i två delar.
• 5. Till en del av satsen sätts (sterilfiltrerad)
  • Inositol ----- 50 mg/L
  • Tiamin ----- 200 mg/L

Till den andra delen görs inga tillsatser

Littman oxgallaagar

Indikation

• Differentialdiagnostik av dermatofyter.

Princip

• Selektivt medium: Kristallviolett (bakteriostatiskt medel) hämmar bakterieväxt.
• Oxgalla hindrar spridning av svampkolonier.
• Speciellt koloniutseende för olika dermatofyter.

Medium/Substrat Littman Oxgall Agar, Difco 0294 55 g

• Ingående komponenter
  • Pepton ----- 10 g
  • Glukos ----- 10 g
  • Oxgalla ----- 15 g
  • Agar ----- 20 g
  • Kristallviolett ----- 0,01 g
  • Ultrarent vatten ----- 1000 mL

pH 7,0 + 0,2 vid 25 °C

• Beredning
  • 1. Blanda pulver och vatten i kolven.
  • 2. Lös under omskakning och kokning. Kontrollera under uppvärmningen att mediet inte fastnar på kolvens botten
  • 3. Autoklavera 15 min vid 121°C

Maltagar

Indikation

• Makro- och mikromorfologi för jäst- och mögelsvamp.

Princip

• Text saknas

Medium/substrat

• Ingående komponenter
  • Destillerat vatten ----- 1000 mL
  • Maltagar (Difco) ----- 45 g

• Ingående komponenter:
  • Maltextrakt Difco ----- 30 g
  • Bacto Agar ----- 15 g

Löses med hjälp av värme

OBS Bränner mycket lätt vid

pH 5,5 ± 0,2

Autoklaveras 20 min vid 120 °C.

Bilaga 3:16

MYCOBIOTICAGAR

Indikation För isolering av framför allt dermatofyter.

Princip Selektivt medium: Cykloheximid hämmar saprofytisk svamp samt vissa patogena svampar Kloramfenikol hämmar bakterier Sojaton är ett enzymatiskt hydrolysat av sojabönsmjöl, vilket gynnar tillväxten av bl. a. svamp.

Medium/ Mycobiotic Agar, Difco 0689 35,6 g Substrat Ingående komponenter: Sojaton 10 g Glukos 10 g Agar 15 g Cykloheximid 0,05 g Kloramfenikol 0,05 g Ultrarent vatten 1000 mL

pH 6,5 + 0,2 vid 25 °C

Beredning 1. Blanda pulver och vatten i kolven. 2. Lös under omskakning och kokning. 3. Autoklavera 10 min vid 121 °C 143

Bilaga 3:17

MODIFIERAD KALIUMNITRATAGAR (MKA)

Indikation För studium av jästsvampars assimilation av nitrat

Princip Differentierande medium: Mediet innehåller nitrat som enda kvävekälla i tillräcklig koncentration för att ge synlig växt. Yeast Carbon Base innehåller låga koncentrationer av aminosyror och vitaminer samt spårelement och salter. Positiva arter gör mediet basiskt och pH-indikatorn slår om till blågrönt-blått.

Medium/ Kaliumnitrat, KNO3, p.a. 0,7 g Substrat Agar Noble, Difco 0142 8 g Bromtymolblått 0,06 g Yeast Carbon Base, Difco 0391 0,8 g Ultrarent vatten 500 mL pH 5,9 - 6,0 vid ca 25 °C

Beredning 1. Blanda ingredienserna med vattnet i kolven. 2. Lös genom omskakning och kokning. 3. Autoklavera 15 min vid 121°C. 144

Bilaga 3:18

NATRIUMTAUROKOLATAGAR

Indikation Bildning av klamydokonidier hos Candida albicans och typiska pseudohyfarrangemang hos andra jästarter.

Medium/ substrat Natrium-Taurokolat Merck 10 g Agar (granulerad BBL) 12 g Destillerat vatten 1000 mL pH 7,5 ± 0,1 Steriliseras 15 min vid 120 °C

145

Bilaga 3:19

POTATISGLUKOSAGAR

Indikation Mikromorfologi hos svamp. Röd-beige färg på baksidan vid växt av T. rubrum

Medium/ substrat Potatisglukosagar (Difco 0013-01-4) 15,6 g Destillerat vatten 400 mL

Beredning Lös genom kokning. Autoklavera 15 min vid 120 °C. pH 5,6 + 0,2 vid 25 °C

146

Bilaga 3:20 Rapid Assimilation Trehalose (RAT)-buljong

Indikation Snabb identifiering av Candida glabrata Utförande av test beskrivs på sid 88

Princip Påvisa C. glabratas snabba trehalosassimilation.

Kemikalier Lösning 1: Yeast Nitrogen Base, Difco 0392-15-9 134 mg Ultrarent vatten 10 mL

Lösning 2: Trehalos, Sigma T-5251 4 g Ultrarent vatten 10 mL

Lösning 3: Bromkresolgrönt, Merck 8121 8 mg Etanol 95% 0,1 mL Natriumhydroxid 0,01 mol/L 0,6 mL Ultrarent vatten 9,3 mL Lösning 4:

Cykloheximid, Sigma C-6255 10 mg Ultrarent vatten 1,0 mL

Beredning Lösning 1: Väg upp substansen direkt i ett skruvlocksrör och tillsätt vattnet. Löses under försiktig uppvärmning och omblandning.

Lösning 2: Väg upp sockret direkt i ett skruvlocksrör och tillsätt vattnet. Löses genom omskakning. Lösningen kan sparas om den sterilfiltreras ned i ett sterilt rör i rumstemperatur.

147

Lösning 3: Väg upp färgen direkt i ett skruvlocksrör och lös den i alkoholen. Tillsätt NaOH och späd med vattnet. Lösningen kan sparas om den sterilfiltreras ned i ett sterilt rör i rumstemperatur.

Lösning 4: Väg upp cykloheximiden direkt i ett skruvlocksrör och lös den i vattnet.

Blanda samman i ett skruvlocksrör de fyra ovan beskrivna lösningarna enligt följande: Lösning 1 8 mL Lösning 2 1 mL Lösning 3 1 mL Lösning 4 40 mL

Kontrollera pH, som skall vara 5,4-5,5 och justera det eventuellt med en droppe NaOH 1 mol/L. Sterilfiltrera mediet ned i ett sterilt skruvlocksrör.

Förvaring RAT-medium: Rumstemperatur Lösningarna 2 och 3: Rumstemperatur Lösningarna 1 och 4 sparas inte.

Hållbarhet RAT-medium: 6 månader Lösningarna 2 och 3: 1 år

OBS! Cykloheximid är giftigt och bör hanteras enligt anvisningarna för arbete med farliga kemikalier.

148

Bilaga 3:21

SABOURAUDAGAR MED STREPTOMYCIN OCH PENICILLIN

Indikation Odling av svamp från bakteriekontaminerat prov.

Princip Peptonet är mycket näringsrikt. Glukostillsatsen samt det låga pH-värdet är också gynnsamt för svampväxt. Penicillin samt streptomycin inhiberar bakterieväxt; svamp påverkas ej.

Medium/ Glukos 4 0 g Substrat Pepton 10 g Agar No 1 13,5 g Ultrarent vatten 1000 mL Färdig Sabouraudagarbas finns tillgänglig (Oxoid, Difco, BBL)

pH 5,6 ± 0,2 vid 25 °C

Penicillin G 6 mg Streptomycin 12,5 mg (lösta i 5 mL ultrarent vatten, steril)

Beredning 1. Blanda glukos, pepton och agar med vattnet i kolven. 2. Lös genom omskakning och kokning. 3. Autoklavera 15 min vid 121 °C Efter autoklavering 4. Efter autoklavering och då mediet tempererats till ca 50 °C tillsättes antibiotikalösningen sterilt 149

Bilaga 3:22 UREAAGAR

Indikation Påvisa ureasaktivitet

Princip Differentierande medium: Peptonet gynnar tillväxten av svamp. pH-indikatorn fenolrött visar alkalisk reaktion (rosaröd färg) då urea p.g.a. ureasaktivitet omvandlas till ammoniak.

Medium/ Basmedium: Substrat Mycological Peptone, Oxoid L 40 1 g Glukos 1 g Natriumklorid, NaCl, p.a. 5 g Dinatriumvätefosfat, Na2HPO4 x 2 H2O, p.a. 1,5 g Kaliumdivätefosfat, KH2PO4, p.a. 0,8 g Fenolrött 0,012 g Agar No 3, Oxoid L 13 12 g Ultrarent vatten 1000 mL

pH 6,8 + 0,2 vid 25 °C

Slutlig blandning Basmedium, autoklaverat 200 mL Urea, 40 %, sterilf. 10 mL/200 mL medium

Beredning Basmedium

1. Blanda alla ingredienser med vattnet i kolven. 2. Lös genom omskakning och kokning. 3. Autoklavera 15 min vid 121°C Efter autoklavering 4. Efter autoklavering eller smältning och då mediet tempererats till 50°C tillsättes urealösningen sterilt. 150

Bilaga 3:23:1

Yeast Nitrogen Base (YNB)-agar med asparagin och glukos modifierad enligt Shadomy

Indikation Resistensbestämning av jästsvamp med diskdiffusion.

Princip Yeast Nitrogen Base (YNB) innehåller små mängder aminosyror, vitaminer och spårelement då vissa svampar saknar förmåga att syntetisera dessa. För att få bättre tillväxt vid resistensbestämning har tillsatts asparagin som en lättillgänglig kvävekälla samt glukos som kol- och energikälla. Kloramfenikol hämmar bakterieväxt.

Medium/ Substrat Natriumfosfatbuffert, pH 7,0; 0,01 mol/L, autoklaverad (se recept nedan) 675 mL Agar No 1 Oxoid L11 7.5 g YNB-buljong 6,7 % sterilfiltrerad (se recept nedan) 75 mL Kloramfenikol 75 mg

pH 7,0+0,2 vid 25°C

Beredning Lös agar i fosfatbuffert i en kolv genom skakning och kokning. Autoklavera 15 min vid 121 °C Temperera lösningen till 50 °C Tillsätt YNB-buljongen Tillsätt kloramfenikol Gjut plattor 20-22 mL per skål.

151

Bilaga 3:23:2

Fosfatbuffert till YNB-agar pH 7,0

Ingredienser Natriumdivätefosfat p.a. NaH2PO4xH2O 0,43 g Dikaliumvätefosfat p.a. K2HPO4 0,85 g Destillerat/avjoniserat H2O till 1000 mL

Beredning Lös fosfaterna i nästan hela vattenmängden under magnetomrörning. Justera pH till 7,0 med syra eller bas Justera slutvolymen med vatten och dispensera på flaskor som autoklaveras 15 min 121 °C. Förvaring Kyl 2-8°C, upp till 1 år

152

Bilaga 3:23:3

YNB-buljong

Kemikalier Yeast Nitrogen Base, Difco 67 g L-asparagin, p.a. 15 g Glukos, p.a. 100 g Destillerat/avjoniserat H2O upp till 1000 mL

Beredning Väg upp substanserna i 1000 mL bägare och lös i ca 800 mL vatten med magnetomrörning. Häll i mätkolven och justera med vatten till 1000 mL. Sterilfiltrera (Ultrafilter 0,2 m, MediaKap®-5) direkt ned i sterila 100 mL flaskor.

Förvaring Kyl 2-8 °C upp till 6 månader.