Bilaga 4. Virologiska metoder

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

---

VIROLOGISKA METODER

Bilaga 4.1

Bestämning av rotavirusantigen i feces med ELISA

ELISA-plattor: Costar EIA/RIA nummer 3590

Tvättbuffert: 0.9% NaCl + 0.05% Tween 20

Antikropp för coatning: Marsvin-antihuman rotavirus-serum (SMI)

Coatningsbuffert: 0.05M sodiumcarbonate, pH 9.5-9.7

Provmaterial: 10% feces-suspension i PBS

Spädningsbuffert: Trypsineringsbuffert med 0.5% BSA

Antikropp för detektion: Kanin-anti-human rotavirus (SMI)

Konjugat: Peroxidasmärkt get-antikanin IgG (Bio-Rad)

Substratbuffert: 0,1M Na-citrat-Hac-buffert pH 6.0 innehållande 0,002% H₂O₂

Substrat: Tetrametyhylbenzidin, TMB (ICN). TMB.stock; lösning 1% 3.3´,5.5´ tetramethylbenzidin upplöst i DMSO.

• Metod:
  • 1. Coata med 100 μL/brunn av marsvin-antihuman rotavirus-serum spätt 1/500 i coatningsbuffert. Inkubera över natt vid +4 °C eller 3 timmar vid +37 °C.
  • 2. Tvätta 4 gånger med tvättbuffert.
  • 3. Späd feces 1/10 i PBS – 0.05% BSA. Tillsätt i duplikat 100 μL/brunn. Inkubera 120 min vid 37 °C.
  • 4. Tvätta 4 gånger med tvättbuffert.
  • 5. Tillsätt 100 μL/brunn av kanin-anti-human rotavirus spätt 1/1000 i spädningsbuffert. Inkubera i 90 min vid 37 °C.
  • 6. Tvätta 4 gånger med tvättbuffert.
  • 7. Tillsätt 100 μL/brunn av peroxidasmärkt get-anti-kanin IgG spätt 1/50 000 i spädningsbuffert. Inkubera i 60 min vid +37 °C.
  • 8. Tvätta 6 gånger med tvättbuffert.
  • 9. Blanda substratlösningen strax innan användning: 100 μL TMB stocklösning i 10 mL substratbuffert. Tillsätt 100 μL/brunn även dör blankavläsning skall göras. Inkubera plattan i 5-10 min vid rumstemperatur.
  • 10. Reaktionen stoppas genom tillsats av 100 μL 2M H₂SO₄/brunn även där blankavläsning skall göras.
  • 11. Avläs vid 450 nm i en ELISA-spektrofotometer.

---

Bilaga 4.3

Metodbeskrivning för analys av adenovirus i feces med PCR-teknik

Faecesprovet blandas med vätska i transportröret/provtagningsröret (virus transportmedium, PBS eller fysiologiskt koksalt) till en 10-20 % suspension och homogeniseras med vortex, gärna med tillsats av glaskulor. Provet överförs sedan till ett eppendorfrör och centrifugeras i 5 min. Hastigheten avgörs av provets sammansättning och man bör erhålla en överfas som går att pipettera. 200 µl av denna övervätska används sedan direkt för extraktion av adenovirus-DNA med hjälp av QIAamp Blood Mini Kit (QIAGEN) enligt medföljande Blood &Body Fluid Spin Protocol.

Arbetet bör ske i sterilbänk (skyddsklass 2) och speciella locköppnare kan användas till eppendorfrören under extraktionen för att minimera risk för kontamination. Prov som innhåller de enteriska varianterna av adenovirus samt prov från immunosupprimerade patienter kan innehålla mycket stora kvantiteter av virus och kontaminationsrisken kan i dessa fall betecknas som stor.

PCR-reaktionen sker i en totalvolym på 50 µl innehållande 10 µl QIAgen-extra-herat prov i 10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, pH 8,0 (20 °C), 200 µM av varje dNTP, 0,5 µM av vardera yttre primer eller 0,5 µM av vardera inre primer samt 1 U Taq DNA polymerase.

• PCR-program första amplifieringssteget:
  • 1. 95 °C 3 min 1 cykel
  • 2. [94 °C 30 s 55 °C 30 s 72 °C 1min] 30cykler
  • 3. 72 °C 3 min 1 cykel

5 µl av amplifieringsprodukt från det första PCR-steget överförs till en ny identisk PCR-mix på 45 µl för nested PCR, dock nu med inre primers. Denna mix blandas på speciellt avgränsad yta endast avsedd för hantering av redan amplifierat material. OBS! PCR-röret från det första amplifieringssteget skall centrifugeras för att avlägsna kondens innan det öppnas för överföring av amplifikat. Detta är mycket viktigt för att undvika eventuell kontaminering.

• PCR-program andra amplifieringssteget; nested PCR:
• 1. 94 °C 1 min 1 cykel
• 2. [94 °C 30 s 55 °C 30 s 72 °C 1min] 30 cykler
• 3. 72 °C 3 min 1 cykel

Efter avslutad amplifiering analyseras 15 µl amplifieringsprodukt från både första och andra (nested) amplifieringsstegen tillsammans med 0,5 µg av en definierad molekylviktsstandard på en 2,0-2,5 % agarosegel av kvalitet med hög upplösning för gel-elektrofores. Varje prov och standarden blandas med 2,0 µl loadingbuffert innan separation på gel. Vid en spänning på 100V +- 30V beräknas en migrationstid på 3 +- 1,5 tim för tillfredställande utvärdering av slutprodukt. Efter slutförd elektrofores infärgas agarosgelen med etidiumbromid (2 µg/ml) i 15 min +- 10 min. (PCR-produkter = 301bp respektive 171bp för enkel och nested PCR).

• Primersekvenser:
  • Hex1deg 5´-GCC (CG)CA (GA)TG G(GT)C (TA)TA CAT GCA CAT C-3´
  • Hex2deg 5´-CAG CAC (GC)CC ICG (AG)AT GTC AAA-3´

Ovanstående primers kombineras med följande primerpar i nested PCR.

• nestHex3deg 5´-GCC CG(CT) GC(AC) ACI GAI AC(GC) TAC TTC-3´
• nestHex4deg 5´-CC(CT) AC(AG) GCC AGI GT(AG) (AT)AI CG(AC) (AG)C(CT) TTG TA-3´

Referens

• Allard, A., B. Albinsson, and G. Wadell (2001). Rapid typing of human adenoviruses by a general PCR combined with restriction endonuclease analysis. J Clin Microbiol. 39:498-505