Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker

Artikel under utarbetande april 2012. Innehållet är preliminärt i väntan på konsensusförfarande

---

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik

och

falldefinitionen [[]]

---

Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker

Bakgrund

Pulsfältgelelektrofores (PFGE) är en av de äldsta metoder för epidemiologisk som fortfarande är i bruk för att jämföra bakterieisolat då misstanke om smittspridning finns. Metoden används sedan 1990-talet för epidemiologisk typning av bland annat meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA) isolat, men intar också en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer.

PFGE baserar sig på att med restriktionsenzymer klyva bakteriens DNA och därefter separera DNA-fragmenten i en agarosgel. Bandmönstret i gelen analyseras sedan visuellt uppstår då som

Internationellt accepterade metoder för PFGE finns ....

PFGE har som grund den ovan beskrivna metoden RFLP, men de restriktionsenzym som används är av ett sådant slag och valda så att betydligt färre men större fragment bildas. Fragmenten är så stora att de måste separeras i ett särskilt instrument som cykliskt ändrar orienteringen av det elektriska fältet under elektroforesen. När denna metod används är det helt avgörande att utgå ifrån intakt DNA (hela DNA-molekylen), innan klyvning sker med lämpligt restriktionsenzym. Konventionella metoder för att isolera DNA kan därför inte användas. I stället gjuts bakterierna in i små agarpluggar innan cellväggarna lyseras med enzym och detergent. Frigjort DNA stabiliseras av agarn. Agarpluggen tvättas noggrant och restriktionsenzym tillåts därefter diffundera in i pluggen och klyva DNA. Agarpluggar med klyvt DNA från bakterier som ska analyseras placeras i brunnarna i agarosgelen. Nackdelen med PFGE är relativt långa arbetskrävande procedurer för att isolera och klyva DNA. Fördelen är en enhetlig metod för epidemiologisk typning av, i princip, alla odlingsbara bakteriearter. Metoden används sedan 1990-talet för epidemiologisk typning av bland annat meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA) isolat, men intar också en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer.

Indikation

För att i epidemiologiskt utredningssyfte jämföra bakterieisolat.

Provmaterial

Renkultur av stafylocker på agarplatta.

Analysprincip

Att extrahera bakteriernas DNA och med restriktionsenzym klyva detta till mindre fragment. DNA-fragmenten separeras efter storlek i agarosgel och ger för stammen ett unikt bandmönster.

Apparatur Termostat 37 och 55°C Centrifug ≤ 12.000 x g Pipett 1-10 µl Pipett 1-40 µl Pipett 40-200 µl Pipett 200-1000 µl Elektroforesutrustning för PFGE UV-bord med kamera Våg 300/3000 g Våg 1 mg- 160 g

Förbrukningsmateriel och reagens Ref stam NCTC 8325 McFarlandrör nr 4 13 ml polypropylenrör Engångsplatinös 1,5 ml centrifugrör Engångstippar till ovanstående pipetter Skalpell Spatlar Petriskål Gjutformar till agarospluggar Dubbeldetsillerat DNAse och RNAse fritt vatten 1M Tris HCl pH 7,5 5 M NaCl 0,5 M EDTA pH 8,0 LMT agaros (2% I EC buffert) FMC Bioproducts Lysostaphin 1 mg/ml i 0,05 M Tris HCl (pH 7,5) 0,15 M NaCl Proteinase K (5mg/ml I d.d. sterilt vatten)

TEN-buffert: 100 mM Tris HCl pH 7,5

                     100 mM EDTA
                     150 mM NaCl

EC-buffert: Trizma Hydroklorid 0,95 g

                     NaCl 58,4g 

Etylendiamintetraättiksyra 29,2 g Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter 5 g N-Lauryl-sarcosin 5 g Natriumdeoxycholat 2 g Dest vatten ca 800 ml Ph justeras med ca 50 ml 5 M NaOH till 7,5

TE-buffert: 10 mM Tris HCl pH 7,6 1mM EDTA

10x TBE buffert: Trizma base 108 g

                     Borsyra H3BO3 55,65 g
                     Titriplex III (Na-EDTA) 7,44 g
                     Dest vatten till 1000 ml

Ultra pure TM agarose Invitrogen Restriktionsenzym Sma 1 med buffert Gel Red

Analyspocedur

DNA extraktion

Över natt kultur bakterier på agarplatta slammas i 500 µl TEN-buffert till täthet 1x 109 bakt/ml i centrifugrör, centrifugeras 10 sek x 7000 x g, dekanteras och resuspenderas i 125 µl EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min.Tillsätt 125 µl 55°C 2% LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert. Tillsätt 12 µl 1 mg/ml lysostaphin, blanda väl genom att pipettera upp o ner några gånger och gjut agarosen i pluggformar med hjälp av pipett.Låt pluggarna stelna i +4°C 10-15 min.Placera pluggarna från respektive isolat i ett centrifugrör. Oftast gjuts två pluggar /isolat, med 1 ml EC-buffert och inkubera i 37°C.Dela en av pluggarna med skalpell i tre delar. Två av bitarna överförs till nytt rör och 250 µl TE-buffert samt 25 µl proteinase K (5 mg/ml) tillsätts. Inkubera 1 timma 55°C.Avlägsna bufferten och tillsätt ny kylskåpskall TE-buffert och detta upprepas 4-5 ggr med 10 min mellanrum. Förvara pluggarna i kyl mellan tvättarna. Pluggarna kan sparas i kyl i 4 °C någon vecka.

Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma 1

1. Späd buffert (10 μl reaktionsbuffert + 90 μl dest.vatten per isolat). 2. Tillsätt 100 μl av ovanstående buffert till varje centrifugrör. 3. Tillsätt 1 μl enzym (= 1Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt. 4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret. 5. Blanda försiktigt och inkubera i 15 minuter vid 37°C. 6. De digererade pluggarana kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.

Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet 1. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 ml 0,5 x TBE-buffert 2. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim. 3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen. Om gel med 15 brunnar används placeras klyvningar från referensstammen lämpligen i brunn nr 2, 8 och 14.

4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 l vatten.) 5. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta. 6. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C. 7. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp. 8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Banden analyseras.