Bilaga 8 (CNS)

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet

---

Bilaga 8

Cytomegalovirus. Detektion av CMV DNA med PCR-tekn;k enligt metod från Sahlgrenska sjukhuset, Göteborg, modifierad vid Smittskyddsinstitutet

Provtagningsmaterial

Cerebrospinalvätska (Csv)

Förvaras vid 4 °C eller -20 °C fram till transporten

Transport vid rumstemperatur

Apparatur

PCR-apparat (TC- 1, Perkin Elmer)

Variabla pipetter, fördelade på arbetsstationer

Elektroforesutrustning

Polaroidkamera

UV-ljusbord

Förbrukningsmaterial

0,5 mL PCR-rör

1,5 mL Eppendorfrör

0,5-10 μL tippar utan filter

0,5-10 μL tippar med filter

10-200 μL tippar utan filter

100-1000 μL tippar utan filter

Reagens

H20: Sterilt vatten (dest.vatten) av hög renhetsgrad

Olja: Mineralolja, light

Primers: Pharmacia Biotech

Förvaras i -20 °C i Rena rummet

Koncentrationer:

1,4 μmol/L: CMVI och CMV2

2,8 μmol/L: CMV3 och CMV4

Samtliga primers är lokaliserade inom fjärde exonet av Major Immediate early gene (UL 122-123)

1:a amplifieringen

• CMV1 5’-GCG CCG CAT TGA GGA GAT CTG CAT-3’
• CMV2 5’-GAG CAC CCT CCT CCT crr CCT CAT-3’

Storlek på PCR-fragment: 299 baspar

2:a amplifieringen

• CMV3 5’-GCC GAT CCT CTG AGA GTC TGC TCT C-3’
• CMV4 5’-CAG CCA CAA TI’A CTG AGG ACA GAG-3’

Storlek på PCR-fragment: 191 baspar

10 x PCR buffert II, Perkin Elmer

Förvaras vid 4 °C.

MgCl₂, Perkin Elmer

Koncentration: 15 mmol/L,

Förvaras vid 4 °C.

dNTP, Pharmacia Biotech

Koncentration: 2 mmol/L används i en blandning av samtliga nukleotider.

Förvaras vid -20 °C.

Enzym, Perkin Elmer

Taq polymeras 5 U/μL

Förvaras vid -20 °C.

Agaros NA, Pharmacia Biotech

Förvaras som pulver i rumstemperatur.

10x TBE-buffert, Karolinska sjukhuset (KS)

pH 8,0-8,4. Späds i H₂O till lx TBE-buffert.

Förvaras i rumstemperatur.

Etidiumbromid (EtBr) KS

Koncentration: 10 mg/mL.

Förvaras i rumstemperatur.

6x Loading buffert, Scandinavian Diagnostic Services (SDS)

Blue orange loading buffert.

Förvaras vid 4 °C.

• 

Provberedning inför 1:a amplifieringen

• Frys likvor vid <=-18 °C.
• Tina i rumstemperatur.
• Sätt 10 μL likvor till 0,5 mL PCR-rör i duplikat.
• Tillsätt 1 droppe (cirka 25 μL) mineralolja. Stäng locket ordentligt.
• Hetta upp likvorprovt i PCR-rören med olja i PCR-maskinen 95 °Ci—10 min.
• De olika momenten i proceduren utförs på fyra separata arbetsstationer för att minimera riskerna för kontamination av prov-DNA med amplifierad produkt.
• Skriv analysprotokoll där 1:a röret är en vattenkontroll och patientprov analyseras i duplikat. Vattenkontroller sätts mellan olika patientduplikat. Positiva kontroller sättes sist.
• Förbehandla likvor enil. provbehandling ovan (sättningsbox).
• Plocka fram reagenserna (ren plats) och blanda mastermix 1 i Eppendorfrör 1,5 mL.
• Sätt upp PCR-rör i still (sättningsbox) inklusive de förbehandlade , provrören enligt analysprotokoll.
• Stäng rören och märk locken med nummer enligt analysprotokoll Oppna ett rör i taget i nummerordning.
• Tillsätt 10 μL H₂0 till vattenkonltroll och en droppe olja ovanpå
• Tillsätt 40 μL mastermix/rör under oljan.
• Stäng rören ordentligt.
• Sätt de positiva kontrollerna sist. Eventuella uppspädning& av positiva kontroller görs efter det att proven är satta och locken ordentligt tillsiutna.

1:a amp1ifieringen

Kör följande program:

5 min 92 °C

(94 °C 30 sek, 57 °C 30 sek, 72 °C I min)x20 cykler

1 min72°C

sök 4 °C

Provberedning inför 2:a amplifieringen

• Gör Mastermix 2 med inre primers (ren plats).
• Sätt upp PCR-rör i ställ.
• Fördela 47,5 μL mastermix/rör
• Tillsätt 1 droppe olja ovanpå.
• Stäng locken och märk locken med nummer enl. analysprotokoll.
• Tag med rören till nestningsplats.
• För över 2,5 μL prov från 1:a steget till de nya rören.

Stor risk för kontamination, öppna därför ett rör i taget.

2:a amplifieringen

Kör följande program:

5 min 92 °C

(94 °C 30 sek, 57 °C 30 sek, 72 °C 30Sek)X30 cykler

1 min 72 °C

Sök 4 °C

Elfores

• Gör i ordning 1,5 %-ig agaros med 0,5 μg EtBr/mlL agaros i lx TBE-buffert. Gjut en gelform med kammar. Lägg ner den stela gelen i elektroforesbadet med 0,5 μg EtBr/mL TBEbuffert.
• På en remsa parafilm droppas 2 μL 6x loadingbUffe1 och blandas med 10 μL PCRprodukt. Sätt 10 μL produkt/hål i gelen.
• Starta aggregatet (140 V).
• Låt gelen gå i ca 20-30 min.
• Stäng av aggregatet och ta upp gelen. Fotografera den på UV-bordet.
• Ta ett kort till analysprotokoflet

Bedömning

• Analysen godkänns om 5 och/eller 10 fg av renat CMV DNA kan detekteras.
• Kontrollera storleken av amplifikat jämfört med den positiva kontrollen.
• Om bägge portionerna av likvorprovet blir positiva indikerar fyndet en CMV-orsakad CNS-infektion
• Om endast ena portionen blir positiv sätts provet om. Om fyndet kan repeteras svaras provet ut positivt, annars negativt.
• Om oklarheter: Sätt om provet, ev i spädning eller efter DNA-extration om det ger smear.