Identifiering-Endemiska mykoser

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Svampinfektioner

---

Identifiering och minimikriterier, svamp

Laboratoriediagnostik av endemiska mykoser

Mikroskopi. Blankophor med NaOH rekommenderas för endemiska mykoser och kan ersätta KOH om UV-ljus används (Bilaga 2). KOH 20 % i DMSO används som alternativ t.ex. vid misstänkt mycetom, kromoblastomykos, feohyfomykos. Det gör det lättare att se pigmentering hos vissa mögel i synligt ljus. 4 % formalin rekommenderas vid misstänkt sporotrikos. För att studera granulae vid mycetom används gramfärgning.

Odling. De rekommenderade standardmedierna är tillfyllest. Vid mycetom rekommenderas tillägg av blodplatta för att hitta aeroba aktinomyceter. Inkubation bör ske i 30 °C och 37 °C under minst 4 veckor.

Serologi. Serologi för coccidioidomykos anses känslig, för histoplasmos acceptabel men med korsreaktioner till blastomykos. Paracoccidioidomykos-serologi är acceptabel. För övriga endemiska mykoser är serologin okänslig eller ej utvecklad.

Hantering av kulturer från dimorfa svampar

Nativt material med dimorfa svampar är inte smittfarligt. När svampen efter utodling växer i sin mögelfas är dock faran stor att infektiösa former sprids och orsakar smitta. Därför måste hanteringen av dimorfa svampar ske på klass 3 säkerhetslaboratorium, AFS 2005:1.

Avdödning av misstänkta dimorfa svampkulturer för att göra preparat sker på följande sätt: Hela kulturen täcks med 10 % formalin som får verka i 48 tim. Därefter kan preparat göras på vanligt sätt.

Mycetom

Direktmikroskopi. Eumykotiska och aktinomykotiska granulae skiljs åt genom mikroskopi (Bilaga 2). Eumykotiska granulae har breda, septerade hyfer, 2-5 µm i diameter, medan aktinomykotiska innehåller tunna bakterietrådar, 0,5-1 µm i diameter, som kan gå över i bacillära och kockoida former.

Odling. En V-formad biopsi från kanten av ett sinus ger bra material. Individuella granulae samlas in, men kan vara kontaminerade med ovidkommande bakterier (ev. kort spritsköljning). Eumykotiska granulae kan odlas på vanlig blodagar och Sabouraudagar med antibiotika och inkuberas i 30 och 37 °C. Synlig svampväxt bör stickas av för att undvika bakteriell kontamination.

De aeroba aktinomyceterna odlas på Löwenstein-Jensen-medium vid 37 °C. Artidentifikation av dessa kan ske med syrafastfärgning (svagare avfärgning) och biokemi.

Serologi är möjlig att utföra med immunelektroosmofores men förutsätter tillgång till specifika antigen och sera mot olika agens, och är inte rutinmetod i landet.

Kromoblastomykos

Direktmikroskopi bör göras från hudskrap, krustor, aspirerat debris och biopsimaterial och studeras i ljus- eller UV-mikroskop (Bilaga 2). I ljusmikroskop ses vid positivt resultat brunpigmenterade grenade hyfer 2-6 mm tjocka. I pus från cystor ser man ofta 3-8 mm skadade hyfer och bruna kroppar upp till 20 mm i diameter, som kan visa tendens till knoppning. Typiska pigmenterade sklerotiska kroppar ses enstaka eller i grupper. De är kastanjebruna och 6-12 mm i diameter. De syns i histopatologiska snitt som sfäriska, tjockväggiga, med dubbel membran. Man kan ofta se former under delning.

Odling kan ske på rutinsvampsubstrat som Sabouraudagar med antibiotika (bilaga 3). Kulturerna bör inkuberas i 25-30 °C i minst 6 veckor innan de besvaras negativa. Artdiagnostik är viktig prognostiskt eftersom Cladosporium svarar bättre på behandling än övriga arter.

Serologi har f.n. ingen plats i diagnostiken.

Feohyfomykos

Direktpreparat studeras i ljus- eller UV-mikroskop (Bilaga 2). I ljusfält är svampelementen oftast mörkbruna men myceldelar utan färg kan ses. Element mellan 3-4 mm till cystor med 25mm diameter förekommer. Odling bör ske på Sabouraudagar (bilaga 3) och inkuberas minst 6 veckor. Scytalidium är cykloheximidkänslig. Vävnadsdelar i form av hårda massor eller noduli bör homogeniseras före odling. En del arter växer först som svart jäst men bildar senare mycel.

Sporotrikos

Direktmikroskopi. Var bör aspireras från djupa abscesser eller satellitlesioner. Asteroidkroppar och cigarrkroppar kan demonstreras med direktpreparat i 95 % av fallen med kutan sporotrikos. En droppe vatten läggs på ett objektglas med en droppe var följt av en droppe 4 % formalin och täcks med täckglas. Blandningen skall vara lätt opak. Betraktas i 40 x 10 förstoring i faskontrast.

Odling. Sporothrix schenckii växer bra på rutindiagnostiska medier om provet kommer från en kutan lesion. Vid misstanke på extrakutan sporotrikos bör upprepade prov och medier som Sabouraud (bilaga 3) och potatisglukosagar (bilaga 3) användas. Mycelformerna växer fram på Sabouraud- och anrikningsmedium efter 3-5 dagar i 24-28 °C. Jästfasen kan fås fram från ursprungsmaterial eller mycelfas vid 35-37 °C på blodagar eller BHI-agar. Kolonierna växer fram på 5 dagar.

Serologi. Serodiagnostiska möjligheter finns och specificiteten är hög vid påvisande av precipiterande IgG-antikroppar mot S. schenckii. Undersökning utförs på Avd. för klin. mikrobiologi, Karolinska sjukhuset (bilaga 8).

Hudtest kan utföras och vara av värde speciellt på immunkompetenta patienter från ickeendemiskt område.

Svampdiagnostik som endast får utföras på säkerhetslaboratorium

Följande svampar får endast handhas på säkerhetslaboratorium klass 3 och med tillstånd av Arbetarskyddsstyrelsen (AFS 1997:12).

Blastomykos

Mikroskopi, odling och histopatologi är de viktigaste diagnostiska möjligheterna vid blastomykos. Vid mikroskopi (bilaga 2) ses ofta den karakteristiska jästfasen med tjockväggiga 8-15 mm citronformade jästceller med en bredbasig knopp.

Mycelfasen av Blastomyces dermatitidis kan odlas fram på Sabouraudagar (bilaga 3) vid 30 °C på ca 4 veckor. Mycelfasen kan konverteras till jästfas på rika medier som BHI-agar (bilaga 3) vid 37 °C.

Jästfasen kan ses direkt i histopatologiska snitt. De inflammatoriska förändringarna är granulomatösa. Även epiteloidcellsgranulom och ostig nekros kan förekomma.

Serologisk IEOP-testning med helcellsantigenpreparationer är föga specifik och korsreaktioner med bl a Histoplasma förekommer allmänt.

Blastomycin hudtest är varken sensitivt eller specifikt.

Coccidioidomykos

Direktpreparat (Bilaga 2) av sekret eller biopsier avslöjar de typiska tjockväggiga upp till 60 mm stora sfäruler som innehåller 2-5 mm stora endosporer. Samma strukturer kan ses vid histopatologisk undersökning av biopsier, bäst med silverfärgning enligt Grocott.

Odling. Coccidioides immitis växer som mycel på de flesta agarmedier efter 7-10 dagar vid 25-37 °C. Dessa mycelformer är mycket virulenta och laboratorieinfektioner har beskrivits upprepade gånger. Hantering av misstänkt mycelform av Coccidioides måste ske i ventilerad box utan recirkulation till rumsluften i säkerhetslaboratorium klass 3. Allt material som använts i samband med mycelformerna måste autoklaveras. Däremot är inte spherulae, dvs biopsier och sekret, smittfarliga. Med tanke på att mycelet kan växa mellan rumstemperatur och 37 °C och är föga substratkrävande bör bandage och annat patientmaterial autoklaverasoch sår m.m, hos patienter läggas om dagligen. Ingen egentlig smitta mellan människor har beskrivits. Om man identifierar ett mycel med artrokonidier behöver en konvertering till spherulae med endosporer ske för att verifiera Coccidioides. Detta liksom exoantigentest kan göras från mycel i kultur.

Hudtest kan ske med mycelantigen, coccidioidin, eller med spherulin, vilka emellertid korsreagerar delvis med H. capsulatum.

Serologi med IEOP och immundiffusion anses värdefulla för diagnos. Immundiffusion anses specifik för coccidioidomykos och blir positiv hos 90 % några veckor efter infektion. Efter 5 månader är bara 10 % positiva. Komplementbindning blir positiv först 3-4 mån efter infektion hos 90 %.

Histoplasmos

Direktpreparat görs gärna med Giemsa-färgning från ofixerat biopsimaterial. Histoplasma capsulatum visar små runda till ovala jästceller. Blankophor med NaOH går också bra. Vid histopatologisk undersökning bör Grocott silverfärgning eller PAS-färgning användas. Typiska jästceller finns inuti makrofager eller jätteceller.

Odling sker på Sabouraud (bilaga 3) eller potatisglukosagar (bilaga 3) med antibakteriella medel. Inkubation i 30 °C i en månad. Dessutom bör odling ske på BHI-agar (bilaga 3) med antibakteriella medel och blodtillsats.

Hudtest kan användas på individer från icke-endemiska områden. Positivt utfall kan tyda på färsk eller genomgången infektion; immundefekta svarar dåligt.

Serologi. Precipiterande antikroppar kan påvisas med IEOP vid färsk eller genomgången infektion. Stigande titrar mellan akut och konvalescentserum kan vara stöd för aktuell infektion. Korsreaktioner mellan Histoplasma och Blastomyces vid immunprecipitation är vanligt.

Histoplasma duboisii

Prov utgörs av pus från abscesser, exsudat från mukosasår, lymfkörtelaspirat, skrap från hudlesioner, aspirat från dränerande sinus, sputum, magsköljvätska samt feces vid tarmsjukdom.

Direktmikroskopi (Bilaga 2) med KOH eller Blankophor, lämpar sig för sekret. Histopatologiska snitt färgas med PAS eller Grocott silverfärgning. Även Giemsa och metylenblåttgår bra för färgning av utstryk. Svampcellerna är 6-15 mm i diameter, ovala med formen av en citron eller ett öga. De kan vara anordnade i kedjor om 3-4 knoppande celler. En eller flera sfäriska fettdroppar finns i cellerna och kan göra illusionen av ett öga fullständig. Histopatologiskt ser man mångkärniga jätteceller på upp till 200 μm fyllda med stora H. duboisii-former.

H. duboisii kan odlas från biopsier eller sekret på Sabouraudagar (bilaga 3) vid 30 °C och bildar på 5-10 dagar en vit till beige senare brun fluffig koloni. Jästfasen kan fås fram vid 37 °C på specialsubstrat. 5-10 % CO₂ underlättar transformationen. Jästformen består av tidigare nämnda citron- eller ögonformade celler.

Hudtest har begränsat diagnostiskt värde.

Serologi. Påvisning av precipiterande antikroppar är diagnostiskt okänslig och utförs ej i Sverige.

Paracoccidioidomykos

Direktpreparat (Bilaga 2) kan göras från biopsier, sputum, var och krustor, varvid Paracoccidioides brasiliensis ses som jästceller 2-10 x 30-60 mm. Cellväggen är dubbelbrytande. Cellerna kan uppträda i kedjor på 4 eller fler. Modercellen har 1-12 smalskaftade knoppar som kan ge det typiska fartygsrattutseendet.

Odling av materialet sker på media som Sabouraudagar (bilaga 3) vid 30 °C. Odling på blodagar med antibiotika men utan cykloheximid bör också ske vid 37 °C. Kolonierna kommer fram efter 15-25 dagar och tillväxer långsamt. Jästformer kan komma fram direkt på blodagar men är känsliga för cykloheximid. Mycelet på 30 °C plattan har inga karakteristika som gör att det kan identifieras, varför konversion på blodagar vid 37 °C är nödvändigt. Histopatologiskt kan man se det typiska styrrattliknande arrangemanget av knoppande jästceller samt Langhans jätteceller, granulom och nekroser.

Penicillios

Penicillios tillhör klass 2 organismer men behandlas här för sammanhangets skull.

Vid direktmikroskopi ses korta böjda celler med tvärsepta samt runda till ovala (jäst)celler utan knoppning. Penicillium marneffei bildar vid odling i 25 °C gröngrått luftmycel med ett rött pigment som diffunderar ut i substratet. Vid 37 °C läderartad mörk koloni.

Cerebral feohyfomykos

Cladophialophora bantiana är en mörkpigmenterad neurotrop svamp som har orsakat ett mindre antal fall av cerebral feohyfomykos.

Kolonierna är långsamväxande, olivgrå till svarta, sammetsartade. Konidioforerna liknar hyfer och är blekbruna. Encelliga blastokonidier förekommer i långa glest grenade kedjor som är föga differentierade från konidiofor och vegetativ hyf. Konidierna är 2-2,5 gånger 7 mm. C. bantiana växer vid 42-43 °C.