Skillnad mellan versioner av "PAR 02 Ziehl-Neelsen färgning"
| (68 mellanliggande sidversioner av 2 användare visas inte) | |||
| Rad 1: | Rad 1: | ||
| + | |||
| + | '''Huvudartikel''', reviderad i mars 2013. | ||
| + | |||
| + | ----- | ||
| + | ''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik]] och [[Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002|Tarminfektioner]]'' | ||
| + | ---- | ||
| + | |||
| + | |||
| + | ==Mikroskopisk påvisning av ''Cryptosporidium, Cyclospora'' och ''Isospora''- oocystor efter modifierad Ziehl-Neelsen-färgning.== | ||
| − | |||
===Analysprincip=== | ===Analysprincip=== | ||
| − | |||
Mikroskopisk påvisning av syrafasta organismer. Provmaterialet droppas/stryks ut på objektglas som lufttorkas, fixeras i metanol, infärgas med karbolfuksin, avfärgas med saltsyra i etanol och bakgrundsfärgas med malakitgrönt. Oocystorna färgas röda mot en grön bakgrund. | Mikroskopisk påvisning av syrafasta organismer. Provmaterialet droppas/stryks ut på objektglas som lufttorkas, fixeras i metanol, infärgas med karbolfuksin, avfärgas med saltsyra i etanol och bakgrundsfärgas med malakitgrönt. Oocystorna färgas röda mot en grön bakgrund. | ||
| − | === | + | ===Speciell utrustning=== |
| − | + | Ljusmikroskop med objektiv 40x, 50x, 100x samt kalibrerat mätokular | |
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
===Reagens=== | ===Reagens=== | ||
| + | *metanol 99.8 % CH<sub>3</sub>OH p.a. | ||
| + | *karbolfuksinlösning | ||
| + | |||
| + | :'''''Alternativ I''''': färdigberedd karbolfuksinlösning (exempelvis Tbcolor från Merck) | ||
| + | |||
| + | :'''''Alternativ II''''': karbolfuksinlösning enligt referens 1 | ||
| + | :basiskt fuksin 10 g | ||
| + | :etanol 99,5% 100 mL | ||
| + | :fenol 50 g | ||
| + | :destillerat vatten 1000 mL | ||
| + | |||
| + | :Lös 10 g basiskt fuksin i 100 mL etanol. Använd en flaska som rymmer minst 1500 mL. Väg upp 50 g fenol i en bägare och lös i en del av vattnet. Blanda alltsammans i flaskan. Sätt till resten av vattnet och blanda på nytt. Observera att fenol är toxiskt och frätande. | ||
| + | |||
| + | *saltsyra i etanol (avfärgningslösning för Ziehl-Neelsen) | ||
| + | :Blanda 10 mL konc HCl med 990 mL 95 % etanol. | ||
| + | *malakitgrönt 1 % | ||
| + | :Lös 1 g malakitgrönt i 100 mL destillerat vatten. | ||
| + | *positiv kontroll ''Cryptosporidium | ||
| + | '' | ||
| + | :Formalinfixerat fecesprov med ''Cryptosporidium''-oocystor | ||
| + | *immersionsolja för ljusmikroskop | ||
| + | |||
| + | ===Analysprocedur=== | ||
| + | ====Förbehandling av prover==== | ||
| − | + | Färgningen utförs i regel på koncentrerad feces. För koncentrering av feces se metodbeskrivning [[PAR 01 Cystor och maskägg, feces koncentration|PAR 01]]. Fecesprover som innehåller rikligt med slem färgas även okoncentrerade. | |
| − | |||
| − | ==== | + | ====Färgningsprocedur==== |
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
| − | |||
Positiv kontroll skall ingå i varje färgningsomgång. | Positiv kontroll skall ingå i varje färgningsomgång. | ||
| − | 1. Märk objektglasets mattfält med labnummer. | + | |
| + | 1. Märk objektglasets mattfält med labnummer. | ||
| + | |||
2. Stryk ut ca 20 µL av provmaterialet på objektglaset. Gör preparatet ca 15 mm i diameter. | 2. Stryk ut ca 20 µL av provmaterialet på objektglaset. Gör preparatet ca 15 mm i diameter. | ||
| − | 3. Låt preparatet lufttorka | + | |
| + | 3. Låt preparatet lufttorka till det är absolut torrt (ca 60 min i rumstemperatur). | ||
| + | |||
4. Fixera glaset 5 min i metanol i glaskyvett med lock. | 4. Fixera glaset 5 min i metanol i glaskyvett med lock. | ||
| − | 5. Lägg glaset på färgstället och täck med | + | |
| + | 5. Lägg glaset på färgstället och täck med karbolfuksin. Färga 20 min. Se anmärkning nedan. | ||
| + | |||
6. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten. | 6. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten. | ||
| − | 7. Avfärga ett glas i taget med avfärgningslösning (saltsyra i etanol) tills den röda färgen är borta. | + | |
| + | 7. Avfärga ett glas i taget med avfärgningslösning (saltsyra i etanol) tills den röda färgen är borta. | ||
| + | |||
8. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten. | 8. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten. | ||
| − | 9. Täck glaset med 1 % malakitgrönt i 3 min. | + | |
| + | 9. Täck glaset med 1 % malakitgrönt i 3 min. Se anmärkning nedan. | ||
| + | |||
10. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten. | 10. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten. | ||
| + | |||
11. Låt preparatet torka. | 11. Låt preparatet torka. | ||
| − | 12. Montera eventuellt med DPX eller | + | |
| − | Avläsning | + | 12. Montera eventuellt med DPX eller annat permanent monteringsmedium och täckglas (ger hållbarare preparat). Låt torka. |
| − | Granska hela preparatet. Använd 40x (förutsätter monterat preparat) eller 50x | + | |
| − | Kvalitetssäkring | + | ====Anmärkning==== |
| − | + | ||
| − | Positiv kontroll: Fecesprov med känt innehåll av formaldehyd- eller SAF-fixerade Cryptosporidium-oocystor. Förvaras i kylskåp och behandlas som övriga prover. | + | Färgningstider för karbolfuksinlösning och malakitgrönt varierar mellan olika publikationer. Bör utprovas lokalt. |
| + | ===Avläsning=== | ||
| + | |||
| + | Granska hela preparatet. Använd 40x (förutsätter monterat preparat) eller 50x immersionsobjektiv för översiktsgranskning och 100x immersionsobjektiv för verifiering. Mät storleken på eventuella oocystor med mätokular. För morfologiska kriterier av olika oocystor se under respektive parasit-avsnitt. | ||
| + | |||
| + | ===Kvalitetssäkring=== | ||
| + | |||
| + | =====Intern===== | ||
| + | |||
| + | Positiv kontroll: Fecesprov med känt innehåll av formaldehyd- eller SAF-fixerade ''Cryptosporidium''-oocystor. Förvaras i kylskåp och behandlas som övriga prover. | ||
| + | Lokal panel innehållande Ziehl-Nelesen-färgade oocystor (''Cryptosporidium'' spp, ''Cyclospora cayetanensis'' och ''Isospora belli''). | ||
För bildmaterial se referens 4 och 5. | För bildmaterial se referens 4 och 5. | ||
| − | + | =====Extern===== | |
| − | UK-NEQAS feces-utskick | + | |
| − | Säkerhetsaspekter | + | Oocystor ingår i UK-NEQAS feces-utskick |
| − | + | ||
| − | Referenser | + | ===Svarsrutiner=== |
| − | 1. Cheesbrough M. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Volume I. Tropical Health Technology Butterworths 1987, 216-218. | + | |
| + | Negativt prov: Inga oocystor påvisade | ||
| + | |||
| + | Positivt prov: T.ex. Oocystor av ''Cryptosporidium'' spp påvisade | ||
| + | |||
| + | ===Säkerhetsaspekter=== | ||
| + | |||
| + | Iaktta försiktighet vid arbete med ej avdödat provmaterial. Behandling med 3,7 % formaldehyd under 30 min avdödar ''Cryptosporidium''-oocystor. | ||
| + | |||
| + | ==Referenser== | ||
| + | |||
| + | 1. Cheesbrough M. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Volume I. Tropical Health Technology Butterworths 1987, 216-218. | ||
| + | |||
2. Gillespie SH, Hawkey PM. Medical Parasitology. IRL Press 1995, 96-97. | 2. Gillespie SH, Hawkey PM. Medical Parasitology. IRL Press 1995, 96-97. | ||
| − | 3: UK-NEQAS Modified Ziehl_Neelsen | + | |
| + | 3: UK-NEQAS Modified Ziehl_Neelsen | ||
http://www.btinternet.com/~ukneqas.parasitologyscheme/Faecal_Scheme/Teaching_Information/Diagnostic_procedures/Permanent_stains/permanent_stains.html | http://www.btinternet.com/~ukneqas.parasitologyscheme/Faecal_Scheme/Teaching_Information/Diagnostic_procedures/Permanent_stains/permanent_stains.html | ||
| − | 4. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 9 Intestinal coccidians and microspora. | + | |
| − | 5. Ash L, Orihel T. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago | + | 4. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 9 Intestinal coccidians and microspora. |
| + | |||
| + | 5. Ash L, Orihel T. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago. | ||
| + | |||
| + | |||
| + | |||
| + | |||
| + | ---- | ||
| + | [[Kategori:Parasiter]] | ||
| + | [[Kategori:Laboratoriediagnostik]] | ||
| + | [[Kategori:Laboratoriediagnostik-parasiter]] | ||
Nuvarande version från 19 mars 2013 kl. 09.42
Huvudartikel, reviderad i mars 2013.
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik och Tarminfektioner
Mikroskopisk påvisning av Cryptosporidium, Cyclospora och Isospora- oocystor efter modifierad Ziehl-Neelsen-färgning.[redigera]
Analysprincip[redigera]
Mikroskopisk påvisning av syrafasta organismer. Provmaterialet droppas/stryks ut på objektglas som lufttorkas, fixeras i metanol, infärgas med karbolfuksin, avfärgas med saltsyra i etanol och bakgrundsfärgas med malakitgrönt. Oocystorna färgas röda mot en grön bakgrund.
Speciell utrustning[redigera]
Ljusmikroskop med objektiv 40x, 50x, 100x samt kalibrerat mätokular
Reagens[redigera]
- metanol 99.8 % CH3OH p.a.
- karbolfuksinlösning
- Alternativ I: färdigberedd karbolfuksinlösning (exempelvis Tbcolor från Merck)
- Alternativ II: karbolfuksinlösning enligt referens 1
- basiskt fuksin 10 g
- etanol 99,5% 100 mL
- fenol 50 g
- destillerat vatten 1000 mL
- Lös 10 g basiskt fuksin i 100 mL etanol. Använd en flaska som rymmer minst 1500 mL. Väg upp 50 g fenol i en bägare och lös i en del av vattnet. Blanda alltsammans i flaskan. Sätt till resten av vattnet och blanda på nytt. Observera att fenol är toxiskt och frätande.
- saltsyra i etanol (avfärgningslösning för Ziehl-Neelsen)
- Blanda 10 mL konc HCl med 990 mL 95 % etanol.
- malakitgrönt 1 %
- Lös 1 g malakitgrönt i 100 mL destillerat vatten.
- positiv kontroll Cryptosporidium
- Formalinfixerat fecesprov med Cryptosporidium-oocystor
- immersionsolja för ljusmikroskop
Analysprocedur[redigera]
Förbehandling av prover[redigera]
Färgningen utförs i regel på koncentrerad feces. För koncentrering av feces se metodbeskrivning PAR 01. Fecesprover som innehåller rikligt med slem färgas även okoncentrerade.
Färgningsprocedur[redigera]
Positiv kontroll skall ingå i varje färgningsomgång.
1. Märk objektglasets mattfält med labnummer.
2. Stryk ut ca 20 µL av provmaterialet på objektglaset. Gör preparatet ca 15 mm i diameter.
3. Låt preparatet lufttorka till det är absolut torrt (ca 60 min i rumstemperatur).
4. Fixera glaset 5 min i metanol i glaskyvett med lock.
5. Lägg glaset på färgstället och täck med karbolfuksin. Färga 20 min. Se anmärkning nedan.
6. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten.
7. Avfärga ett glas i taget med avfärgningslösning (saltsyra i etanol) tills den röda färgen är borta.
8. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten.
9. Täck glaset med 1 % malakitgrönt i 3 min. Se anmärkning nedan.
10. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten.
11. Låt preparatet torka.
12. Montera eventuellt med DPX eller annat permanent monteringsmedium och täckglas (ger hållbarare preparat). Låt torka.
Anmärkning[redigera]
Färgningstider för karbolfuksinlösning och malakitgrönt varierar mellan olika publikationer. Bör utprovas lokalt.
Avläsning[redigera]
Granska hela preparatet. Använd 40x (förutsätter monterat preparat) eller 50x immersionsobjektiv för översiktsgranskning och 100x immersionsobjektiv för verifiering. Mät storleken på eventuella oocystor med mätokular. För morfologiska kriterier av olika oocystor se under respektive parasit-avsnitt.
Kvalitetssäkring[redigera]
Intern[redigera]
Positiv kontroll: Fecesprov med känt innehåll av formaldehyd- eller SAF-fixerade Cryptosporidium-oocystor. Förvaras i kylskåp och behandlas som övriga prover. Lokal panel innehållande Ziehl-Nelesen-färgade oocystor (Cryptosporidium spp, Cyclospora cayetanensis och Isospora belli). För bildmaterial se referens 4 och 5.
Extern[redigera]
Oocystor ingår i UK-NEQAS feces-utskick
Svarsrutiner[redigera]
Negativt prov: Inga oocystor påvisade
Positivt prov: T.ex. Oocystor av Cryptosporidium spp påvisade
Säkerhetsaspekter[redigera]
Iaktta försiktighet vid arbete med ej avdödat provmaterial. Behandling med 3,7 % formaldehyd under 30 min avdödar Cryptosporidium-oocystor.
Referenser[redigera]
1. Cheesbrough M. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Volume I. Tropical Health Technology Butterworths 1987, 216-218.
2. Gillespie SH, Hawkey PM. Medical Parasitology. IRL Press 1995, 96-97.
3: UK-NEQAS Modified Ziehl_Neelsen http://www.btinternet.com/~ukneqas.parasitologyscheme/Faecal_Scheme/Teaching_Information/Diagnostic_procedures/Permanent_stains/permanent_stains.html
4. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 9 Intestinal coccidians and microspora.
5. Ash L, Orihel T. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago.