Skillnad mellan versioner av "Bilagor till VRE-diagnostiken"

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
 
(9 mellanliggande sidversioner av samma användare visas inte)
Rad 9: Rad 9:
 
====Diagnostiska minimikriterier
 för artdiagnostik 
av enterokocker (referensmetodik)====
 
====Diagnostiska minimikriterier
 för artdiagnostik 
av enterokocker (referensmetodik)====
  
*''Enterococcus'' spp: Minimikriterier:
 Typisk kolonimorfologi, grampositiv
, katalasnegativ, galla-eskulin-positiv, alternativt positiv i agglutinationstest för grupp D, PYR-positiv
. Andra egenskaper: Gråvita kolonier på blodagar, kan ha ingen hemolys, alfa- eller betahemolys, oftast gula kolonier på CLED-agar. Växer i buljong med 6,5 % NaCl ('''Tabell 4''')
+
*''Enterococcus'' spp: Minimikriterier:
 Typisk kolonimorfologi (gråvita kolonier på blodagar, kan ha ingen hemolys, alfa- eller betahemolys, oftast gula kolonier på CLED-agar), katalasnegativa grampositiva kocker i par eller korta kedjor, PYR- och eskulin-positiva. Ytterligare egenskaper för enterokocker är förmåga att växa i buljong med 6,5 % NaCl, positiv i agglutinationstest för Lancefields grupp D.
 +
 
 +
För diffentiering av enterokocker se
('''Tabell 4''')
  
 
[[Fil:Tabell 4 enterokocker 0001.jpg|thumb|center|700px||]]
 
[[Fil:Tabell 4 enterokocker 0001.jpg|thumb|center|700px||]]
  
 +
------------
  
 
===Bilaga 2===
 
===Bilaga 2===
Rad 47: Rad 50:
  
 
Todd-Hewittbuljong tillreds enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt vankomycin 4 mg/L och aztreonam 60 mg/L.
 
Todd-Hewittbuljong tillreds enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt vankomycin 4 mg/L och aztreonam 60 mg/L.
 +
 +
----------------
  
 
===Bilaga 3===
 
===Bilaga 3===
 
====PCR-metod för påvisande av van-gener====
 
====PCR-metod för påvisande av van-gener====
  

vanA och vanB PCR för LightCycler (FRET-hybridiseringsprobe)Reaktionsvolymen är 20 μL varav 5 μl är templat. PCR mixen innehåller 1xHYB- master (Roche Diagnostics), 2 mM MgCl2, 1 μM av varje primer och 0.2 μM av varje hybridiserings-probe.Primers
vanA-F 5 ́-TCGGCAAGACAATATGACAG-3 ́ vanA-R 5 ́-GTACAATGCGGCCGTTA-3 ́ vanB-F 5 ́-GAGGATGGTGCGATACA-3 ́ vanB-R 5 ́-GATGGATGCGGAAGATA-3 ́Prober
vanA-FL 5 ́-ACGCAGTTATAACCGTTCCCG -FL-3 ́
vanA-705 5 ́-LC705-AGACCTTTCAGCAGAGGAGCG-PH-3 ́ vanB-FL 5 ́-CCTGTCTTTGTGAAGCCG-FL-3 ́
vanB-640 5 ́-LC640-CACGGTCAGGTTCGTCCTTTGGCGT-PH-3 ́Storlek på PCR-fragmentet för vanA är 322 baspar och för vanB 423 baspar.Temperaturprofil LightCycler
Enzymaktivering: 95 oC 10 min. Slope 20 oC/s. 1 cykel.
Amplifiering: 95 oC 15 sek, 50 oC 15 sek, 72 oC 25 sek. 40 cykler. Slope 20 oC/s. Kylning: 40 oC 60 sek. Slope 20 oC/s.
Avläsning med color compensation. VanA och vanB avläses i olika kanaler. Smältpunktanalys behövs inte.VanA och vanB PCR för Rotor-Gene (TaqMan probe)Reaktionsvolymen är 20 μL varav 2 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x perfeCta qPCR FastMix (Quanta bioscience), 0,2 μM av varje primer, 0,075 μM av varje Taqman-probe.Primers
vanA-F 5 ́-CGGCAAGACAATATGACAGCAA-3 ́ vanA-R 5 ́-TCAGTACAATGCGGCCGTTA-3 ́ vanB-F 5 ́-GGGAGGATGGTGCGATACA-3 ́ vanB-R 5 ́-CCGAAA TCGCTTGCTCAA-3 ́Prober    vanA 5 ́HEX-CAGTTATAACCGTTCCCGCAGACCTT-BHQ1-3 ́    vanB  5 ́6FAM-CTTTGTGAAGCCGGCACGGTCAGGTT-BBQ-3 ́ Storlek på PCR-fragmentet för vanA är 322 baspar och för vanB 329 baspar.61Temperaturprofil för Rotor-Gene
Enzymaktivering: 95 oC i 3 min
Amplifiering: 95 oC i 3 sek, 60 oC i 20 sek. 40 cykler.
VanA och vanB avläses i olika kanaler. Smältpunktanalys behövs inte.PCR-metod för molekylärbiologisk verifiering av E. faecalis och E. faecium DdlE PCR för LightCyclerReaktionsvolymen är 20 μL varav 4 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x LC- master, 4 mM MgCl2, 0,5 μM av varje primer och 0,04 units/μL FastStart Taq DNA-polymeras.LC-master innehåller 2x FastStart PCR-buffert (Roche diagnostics), 4 % DMSO (Sigma), 0,4 mM dNTP (Roche diagnostics), 0,2 mg/mL BSA (Roche diagnostics) och 1,2x SybrGreen I (Molecular Probes).Primer
EFS-F 5 ́-CACCTGAAGAAACAGGC-3 ́ EFS-R 5 ́-ATGGCTACTTCAATTTCACG-3 ́EFM-F 5 ́-AATAATAAAATCGAAATGCAGATTCC-3 ́ EFM-R 5 ́-TCCAGCCTCTTCTTTATTTCTCTTTAT-3 ́Storleken på DNA-fragmentet för E. faecalis är 475 baspar och för E. faecium 335 baspar.Temperaturprofil LightCycler
Enzymaktivering: 95 oC 10 min. Slope 20 oC/s. 1 cykel.
Amplifiering: 95 oC 15 sek, 54 oC 10 sek, 72 oC 25 sek. 35 cykler. Slope 20 oC/s. Smältpunktsanalys: 60–90 oC. Slope 0,1 oC/s
Kylning: 40 oC 30 sek. Slope 20 oC/s.Avläsning: Metoden är en cybergreen metod och läses av i våglängd 530 nm. Positiva prov ska uppvisa en amplifieringskurva samt att produkten ska ha en smälttopp runt 84–85 oC.62
+
'''''
vanA'' och ''vanB'' PCR för LightCycler (FRET-hybridiseringsprobe)'''
 +
 
 +
Reaktionsvolymen är 20 μL varav 5 μl är templat. PCR mixen innehåller 1xHYB- master (Roche Diagnostics), 2 mM MgCl2, 1 μM av varje primer och 0.2 μM av varje hybridiserings-probe.
 +
 
 +
 
 +
[[Fil:VanAochvanB_LightCycler.jpg|thumb|center|600px||]]
 +
*'''Temperaturprofil LightCycler'''
 +
**
Enzymaktivering: 95 °C 10 min. Slope 20 °C/s. 1 cykel.
 +
**Amplifiering: 95 °C 15 sek, 50 °C 15 sek, 72 °C 25 sek. 40 cykler. Slope 20 °C/s.  
 +
**Kylning: 40 °C 60 sek. Slope 20 °C/s.
 +
 
 +

Avläsning med color compensation. ''VanA'' och ''vanB'' avläses i olika kanaler.  
 +
 
 +
Smältpunktanalys behövs inte.
 +
 
 +
------------------------
 +
'''''VanA'' och ''vanB'' PCR för Rotor-Gene (TaqMan probe)'''
 +
 
 +
Reaktionsvolymen är 20 μL varav 2 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x perfeCta qPCR FastMix (Quanta bioscience), 0,2 μM av varje primer, 0,075 μM av varje Taqman-probe.
 +
 
 +
 
 +
[[Fil:VanAochvanB_Rotor-Gene.jpg|thumb|center|600px||]]
 +
   
 +
*'''Temperaturprofil för Rotor-Gene
'''
 +
**Enzymaktivering: 95 °C i 3 min
 +
**
Amplifiering: 95 °C i 3 sek, 60 °C i 20 sek. 40 cykler.
 +
 
 +
''VanA'' och ''vanB'' avläses i olika kanaler. Smältpunktanalys behövs inte.
 +
-----------------------------
 +
 
 +
'''PCR-metod för molekylärbiologisk verifiering av ''E. faecalis'' och ''E. faecium''
 +
 
 +
'''''DdlE''-PCR för LightCycler''': Reaktionsvolymen är 20 μL varav 4 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x LC- master, 4 mM MgCl2, 0,5 μM av varje primer och 0,04 units/μL FastStart Taq DNA-polymeras.
 +
 
 +
LC-master innehåller 2x FastStart PCR-buffert (Roche diagnostics), 4 % DMSO (Sigma), 0,4 mM dNTP (Roche diagnostics), 0,2 mg/mL BSA (Roche diagnostics) och 1,2x SybrGreen I (Molecular Probes).
 +
 
 +
 
 +
[[Fil:VerifieringEnterokocker.jpg|thumb|center|600px||]]
 +
 
 +
 
 +
*'''Temperaturprofil LightCycler'''
 +
**
Enzymaktivering: 95 °C 10 min. Slope 20 °C/s. 1 cykel.
 +
**
Amplifiering: 95 °C 15 sek, 54 °C 10 sek, 72 °C 25 sek. 35 cykler. Slope 20 °C/s.  
 +
**Smältpunktsanalys: 60–90 °C. Slope 0,1 °C/s

 +
**Kylning: 40 °C 30 sek. Slope 20 °C/s.
 +
 
 +
Avläsning: Metoden är en cybergreenmetod och läses av i våglängd 530 nm. Positiva prov ska uppvisa en amplifieringskurva samt att produkten ska ha en smälttopp runt 84–85 °C.
 +
 
 +
[[Kategori:Laboratoriediagnostik]]
 +
[[Kategori:Smittskyddslagens sjukdomar]]

Nuvarande version från 19 juli 2012 kl. 11.33

Artikel publicerad februari 2012. Texten är preliminär ännu ej godkänd genom konsensusförfarande


Till huvudartikeln Vankomycinresistenta enterokocker (VRE), referensmetodik


Bilagor till VRE-diagnostiken[redigera]

Bilaga 1[redigera]

Diagnostiska minimikriterier
 för artdiagnostik 
av enterokocker (referensmetodik)[redigera]

  • Enterococcus spp: Minimikriterier:
 Typisk kolonimorfologi (gråvita kolonier på blodagar, kan ha ingen hemolys, alfa- eller betahemolys, oftast gula kolonier på CLED-agar), katalasnegativa grampositiva kocker i par eller korta kedjor, PYR- och eskulin-positiva. Ytterligare egenskaper för enterokocker är förmåga att växa i buljong med 6,5 % NaCl, positiv i agglutinationstest för Lancefields grupp D.

För diffentiering av enterokocker se
(Tabell 4)

Tabell 4 enterokocker 0001.jpg

Bilaga 2[redigera]


Anrikningsmedium för VRE-screening[redigera]

  • Galla-eskulinbuljong (Referenssubstrat):
    • Typexempel Bile Esculin Azide Broth (Biolife) 42.7 g/L
    • Innehåll------ Gram/L
    • Trypton -------17
    • Pepton --------3
    • Jästextrakt------ 5
    • Oxgalla-------- 10
    • Natriumklorid------ 5
    • Natriumcitrat------ 1
    • Eskulin---------- 1
    • Fe-ammonium-citrat------ 0,5
    • Natriumazid-------0,25
  • pH 7.1± 0.2

Galla-eskulinbuljong tillreds enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt vankomycin 4 mg/L och aztreonam 60 mg/L.

  • Alternativ anrikningsbuljong (Todd-Hewittbuljong)
    • Typexempel:T-H-buljong (BD)
    • Innehåll --------Gram/L
    • Infusion av kött------ 3,1
    • Neopepton------20,0
    • Dextros------ 2,0
    • Natriumklorid------ 2,0
    • Dinatriumfosfat------ 0,4
    • Natriumkarbonat------ 2,5
  • pH 7,8± 0.2

Todd-Hewittbuljong tillreds enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt vankomycin 4 mg/L och aztreonam 60 mg/L.


Bilaga 3[redigera]

PCR-metod för påvisande av van-gener[redigera]


vanA och vanB PCR för LightCycler (FRET-hybridiseringsprobe)

Reaktionsvolymen är 20 μL varav 5 μl är templat. PCR mixen innehåller 1xHYB- master (Roche Diagnostics), 2 mM MgCl2, 1 μM av varje primer och 0.2 μM av varje hybridiserings-probe.


VanAochvanB LightCycler.jpg
  • Temperaturprofil LightCycler
    • 
Enzymaktivering: 95 °C 10 min. Slope 20 °C/s. 1 cykel.

    • Amplifiering: 95 °C 15 sek, 50 °C 15 sek, 72 °C 25 sek. 40 cykler. Slope 20 °C/s.
    • Kylning: 40 °C 60 sek. Slope 20 °C/s.


Avläsning med color compensation. VanA och vanB avläses i olika kanaler.

Smältpunktanalys behövs inte.


VanA och vanB PCR för Rotor-Gene (TaqMan probe)

Reaktionsvolymen är 20 μL varav 2 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x perfeCta qPCR FastMix (Quanta bioscience), 0,2 μM av varje primer, 0,075 μM av varje Taqman-probe.


VanAochvanB Rotor-Gene.jpg
  • Temperaturprofil för Rotor-Gene

    • Enzymaktivering: 95 °C i 3 min
    • 
Amplifiering: 95 °C i 3 sek, 60 °C i 20 sek. 40 cykler.


VanA och vanB avläses i olika kanaler. Smältpunktanalys behövs inte.


PCR-metod för molekylärbiologisk verifiering av E. faecalis och E. faecium

DdlE-PCR för LightCycler: Reaktionsvolymen är 20 μL varav 4 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x LC- master, 4 mM MgCl2, 0,5 μM av varje primer och 0,04 units/μL FastStart Taq DNA-polymeras.

LC-master innehåller 2x FastStart PCR-buffert (Roche diagnostics), 4 % DMSO (Sigma), 0,4 mM dNTP (Roche diagnostics), 0,2 mg/mL BSA (Roche diagnostics) och 1,2x SybrGreen I (Molecular Probes).


VerifieringEnterokocker.jpg


  • Temperaturprofil LightCycler
    • 
Enzymaktivering: 95 °C 10 min. Slope 20 °C/s. 1 cykel.
    • 
Amplifiering: 95 °C 15 sek, 54 °C 10 sek, 72 °C 25 sek. 35 cykler. Slope 20 °C/s.
    • Smältpunktsanalys: 60–90 °C. Slope 0,1 °C/s

    • Kylning: 40 °C 30 sek. Slope 20 °C/s.

Avläsning: Metoden är en cybergreenmetod och läses av i våglängd 530 nm. Positiva prov ska uppvisa en amplifieringskurva samt att produkten ska ha en smälttopp runt 84–85 °C.