Diagnostik vid nedre luftvägsinfektioner orsakade av bakterier

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Nedre luftvägsinfektioner, 2:a upplagan 2005

---

Diagnostik av nedre luftvägsinfektioner orsakade av bakterier

Odling

Odling karakteriseras dels som allmän dels som riktad. Allmän odling är referensmetod för påvisande av vanliga bakteriella patogener vid pneumoni, empyem och lungabscess. Stor hänsyn måste tas till patientens sjukdomsbild och immunstatus liksom till provtyp och transportförhållanden. Normalflora och kolonisation påverkar bedömningen. Kvantitativ odling kan öka specificiteten. Referensmetodik för allmän odling behandlas i ett särskilt avsnitt.

Riktad odling varierar med misstänkt etiologiskt agens och behandlas därför huvudsakligen under respektive organism.

Teknik baserad på nukleinsyraamplifiering vid bakteriella infektioner

Polymerase chain reaction (PCR) är ett hjälpmedel som avsevärt bidragit till att underlätta påvisandet av bakterier. Med tekniken utnyttjas naturens eget sätt att kopiera DNA och en för den sökta bakterien unik DNA-sekvens mångfaldigas under förutsättning att den finns i provet. Med s.k. primrar, syntetiskt tillverkade korta enkelsträngade DNA-sekvenser, anges vilket DNA som skall kopieras. Genom ett cykliskt förfarande kan DNA från en enda bakterie kopieras till ett antal av mellan 109 -1012. Denna relativt stora mängd nukleinsyra kan sedan på olika sätt lätt detekteras vilket gör PCR-tekniken till en mycket känslig metod. Även döda mikroorganismer kan identifieras.

Vid bakteriella nedre luftvägsinfektioner har PCR-tekniken fått sin främsta användning vid diagnostik av de svårodlade mikroorganismerna Mycoplasma pneumoniae och Chlamydophila pneumoniae. Något som också kan komplicera odlingsdiagnostiken av ovanstående bakterier är att kvantiteten av den sjukdomsfram¬allande mikroorganismen ofta sjunker hos patienten några dagar efter insjuknandet både som ett resultat av en naturlig process men också på grund av att många patienter antibiotikabehandlats en tid innan det aktuella provtagningstillfället. I de här fallen är också PCR-teknikens höga känslighet användbar.

PCR-tekniken har inneburit att provsvar kan lämnas, i de flesta fall redan dagen efter provets ankomst till laboratoriet, med både hög specificitet och sensitivitet. Emellertid får vi inte någon kännedom om bakteriens känslighet för antimikrobiella medel. För att lösa denna typ av frågeställningar krävs fortfarande odling. Visserligen kan molekylärbiologiska tekniker, ofta inkluderande PCR, användas för påvisandet av resistens och resistensmekanismer. Men för bakterier involverade i NLI är det endast för påvisandet av mecA-genen hos S. aureus som tekniken används rutinmässigt och inte främst i forskningssyfte. Även typning av bakterier av betydelse för den epidemiologiska övervakningen sker numera oftast med molekylärbiologiska tekniker, huvudsakligen på regionsjukhusen och fortfarande först efter föregående renodling.

Realtids-PCR är en utveckling av konventionell PCR-teknik. Den kan användas kvantitativt med stöd av en standardkurva. Den kan också användas kvalitativt och har då fördelen över klassisk PCR av att resultaten genereras i realtid och inte kräver separata arrangemang, såsom t.ex. agarosgel-elektrofores, för att detektera den amplifierade nukleinsyran. Resultaten är baserade på hybridisering med specifik probe till den mångfaldigade nukleinsyran vilket innebär att tidsödande kompletterande tekniker, t.ex. southern blottning, för maximal sensitivitet och specificitet elimineras. Den sammantagna analystiden blir härigenom också kortare. Vid realtids-PCR kombineras mångfaldigandet av mål-DNA med detektion av produkten i samma reaktionsrör och risken för kontamination har därmed minskat avsevärt.

Multiplex PCR innebär att flera olika nukleinsyrasekvenser kan detekteras vid en och samma reaktion. Detta kan synas användbart då flera olika mikrobiella agens kan vara möjliga orsaker till patientens symtom. Det innebär dock tekniska svårigheter att designa primrar som inte stör varandra i reaktionen och det är sällan mer än 2-3 agens kan detekteras samtidigt.

16S och 23S rRNA

Den här typen av nukleinsyrapåvisning är baserad på PCR med primrar som detekterar konserverade nukleinsyrasekvenser av de bakteriella kromosomala generna som kodar för 16S resp. 23S ribosomalt RNA (rRNA). Dessa sekvenser kan alltså detekteras hos i det närmaste alla bakterier. Den resulterande amplifierade nukleinsyran innehåller också variabla regioner som ger oss möjlighet att definiera species. 23S och i synnerhet 16S rRNA-generna kan alltså i ett första skede användas för att detektera bakterier i allmänhet och genom efterföljande sekvensering och jämförelse av sekvensen med dem i databaser som t.ex. BLAST från NCBI, kan en artbestämning fås. Förutsättning för metoden är att bakterien är i ren kultur.

Bakteriespecifik PCR och sekvensbestämning kan emellertid bara utföras på en bakteriearts nukleinsyra i taget. Då prov från NLI också innehåller bakterier från den normala svalgfloran kan dessa prov inte analyseras avseende förekomst av den generella genen för t.ex. 16S rRNA utan att falskt positiva resultat erhålls. Tekniken används endast i undantagsfall vid NLI och då på framodlade bakterier vars art inte kunnat identifieras exempelvis p.g.a. klen växt.

Antigendetektion

Antigendetektion i urin har visat stor användbarhet för diagnostik av infektion orsakade av Legionella pneumophila serogrupp 1 och anges där som referensmetod.

Påvisande av pneumokockantigen vid pneumoni har också visats kunna höja sensitiviteten vid diagnostik av pneumokockpneumoni.

Serologi

Infektionsserologi har varierande diagnostisk ställning beroende på etiologiskt agens. Generellt ger serologin sen information eftersom acceptabel korrelation till infektionstillfället kräver akut- och konvalescentserum. Vid studier av exempelvis vaccineffektivitet är parad serologi nödvändigt komplement för att uppnå tillfredsställande diagnostisk sensitivitet. Singelserumdiagnostik kan vara vilseledande då förhöjda antikroppskoncentrationer kan ligga kvar över ett år efter det aktuella infektionstillfället.

Epidemiologisk typning

För det epidemiologiska arbetet vid t.ex. utbrottssituationer utnyttjas allt oftare det faktum att mikroorganismer med gemensamt, klonalt, ursprung har genetiskt identiska eller mycket lika nukleinsyra. Det finns dessutom en tillräckligt stor genetisk diversitet inom en bakterieart för att olika kloner ska kunna urskiljas bland stammar som samlats in från t.ex. olika lokaler eller tidpunkter.

Utvecklingen av isolering, separation och mångfaldigande av nukleinsyra under de senast årtiondena har lett till att ett flertal nukleinsyrabaserade subtypningsmetoder tagits fram. En av dessa är puls-fält-gel-elektrofores (PFGE) utvecklad av Schwartz och Cantor 1984. PFGE har använts på ett stort antal organismer och har då visat sig ha hög diskriminerande förmåga och reproducerbarhet och visat sig vara jämförbar eller överlägsen andra tillgängliga tekniker. Metoden ger genetisk information i form av ett karakteristiskt bandmönster av organsimens kromosomala DNA efter gelelektrofores. Ett restriktionsenzym används som klyver bakteriens DNA till fragment som sedan separeras i storleksordning i agarosgel under speciella elektroforetiska förhållanden. DNA fragmenten är 20–750 kbp. Då fragment som är större än 40 kbp inte kan separeras effektivt i konventionell gelelektrofores används utrustning som cykliskt alternerar orienteringen av det elektriska fältet. På det här sättet kan även stora DNA-fragment, fås att förflytta sig i agarosgelen, med en hastighet som står i proportion till fragmentens storlek.

Det är viktigt att DNA hålls intakt fram till det moment då det klyvs med restriktionsenzym. En suspension av bakterier gjuts därför in i agarospluggar innan bakterierna lyseras med hjälp av enzymer och detergenter. När den stora kromosomala DNA-molekylen hålls på plats av agarosen kan andra molekyler av cellrester tvättas bort. Klyvningen av DNA sker sedan med ett restriktionsenzym som valts efter sin förmåga att känna igen och klyva DNA så att relativt få (ca 15-20 stycken) men stora fragment erhålls. Agarospluggen som innehåller den restriktionsenzymkluvna DNA-molekylen utsätts härefter för PFGE. På det sättet har varje bakterieklon ett unikt mönster av DNA-fragment som kan databehandlas och lagras i databaser för framtida jämförelser. Antalet gemensamma band hos olika bakterieisolat räknas. Förekomst av flera gemensamma band indikerar ett närmare släktskap. Helt identiska bandmönster indikerar ett klonalt ursprung.

En nackdel hos metoden är att det visat sig vara svårt att definiera och namnge bandmönster. Den något bristfälliga nomenklaturen har försvårat kommunikationen mellan laboratorier rörande förekomst eller ej av olika bakteriekloner. Framtiden får utvisa om PFGE kommer att kompletteras av andra metoder med högre kommunicerbarhet.

REFERENS

Schwartz D.C. and Cantor C.R. 1984. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient electrophoresis. Cell 37:67-75.