Screeningmetodik för ESBL

Artikel under utarbetande mars 2012. Innehållet är preliminärt i avvaktan på konsensusbeslut

---

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar

och

falldefinitionen ESBL-producerande Enterobacteriaceae

---

Screeningmetoder för ESBL

Bakgrund

ESBL indelas i tre huvudgrupper; ESBL_A, ESBL_M och ESBL_CARBA. ESBL_A är hittills dominerande i Sverige, men ESBL_M, i första hand av subgrupp CIT förekommer också. Antalet anmälda fall av ESBL(_Aeller_M) har stadigt ökat från 2008 (år 2007 då anmälningsplikt infördes för laboratorier) till mer än 5000 (år 2011). Beträffande Enterobacteriaceae med ESBL_CARBA som sedan 15 mars 2012 är anmälningspliktig för både laboratorium och behandlande läkare, inkluderades denna variant av ESBL i den svenska definitionen för ESBL år 2009 (ref: [1]). Från 2007 till 2011 fanns 35 fall rapporterade till Smittskyddsinstitutet och av dessa var det stora flertalet smittade utomlands. Enterobacteriaceae med ESBL_CARBA är smittspårningspliktiga. Aktuella föreskrifter (SOSFS 2012:1, 2012:2 och 2007:1) finns på Socialstyrelsens webbplats.

Screeningmetoden följer de rekommendationer som anges i SMI:s kunskapsunderlag [ESBL-producerande tarmbakterier] som publiceras våren 2013.

De flesta laboratorier i landet har etablerat metoder för screening av ESBL-producerande tarmbakterier. Dessa baseras på användningen av kommersiella agarplattor (t ex Oxoid, bioMérieux), egentillverkade agarmedier med antibiotikalappar eller selektiv buljonganrikning. Litteraturstöd saknas i dagsläget för att buljonganrikning skulle ha högre känslighet än övriga metoder.

För screeningändamål kan ett cefalosporin som är substrat för samtliga ESBL-varianter användas, exempelvis cefpodoxim. Däremot är metodik som baserar sig på endast en av cefotaxim eller ceftazidim inte tillräcklig, eftersom vissa ESBL-enzymer inte orsakar resistens mot båda dessa cefalosporiner.

Referensmetodik

Provmaterial

Till följd av brist på data som stödjer att buljonganrikning skulle ge högre känslighet anses bruket av screening-agarplattor (feces, rektumprov på pinne) vara referensmetodik för primärisolering av ESBL.

Referenssubstrat

Egentillverkade substrat: Två plattor vardera med agarbaserat substrat (exempelvis MacConkey), en innehållande cefotaxim 1 mg/L och en innehållande ceftazidim 1 mg/L.

Kommersiella substrat: Flera kommersiella screeningagarmedier har jämförts i olika studier, och uppvisar goda prestanda när det gäller detektion av ESBL_A. Känsligheten för detektion av ESBL_M är sämre, eftersom man ofta har tillsatt AmpC-hämmare till mediet. Detta görs för att med hög specificitet detektera ESBL_A, vilket är relevant i många länder utanför Norden. Se också artikel Kromogena substrat.

Karbapenemaser kan med hög känslighet påvisas med de beskrivna substraten, eftersom dessa i de allra flesta fall även orsakar cefalosporinresistens. Undantag är karbapenemasen OXA-48 som ibland kan orsaka låggradig karbapenemresistens utan samtidig cefalosporinresistens. Kommersiella plattor innehållande karbapenemer har hög specificitet, men för låg känslighet för att generellt kunna rekommenderas för detektion av karbapenemas-bildande bakterier.

För detektion av OXA-48 kan kommersiella screeningplattor för karbapenemaser (innehåller oftast ertapenem) eller egentillverkade substrat med tillsats av ertapenem eller meropenem (0, 25 mg/L). Alternativ kan vara MacConkey med meropenemlapp i första stryket.

Provsättning och inkubering

Proven stryks på plattorna enligt gängse odlingsprinciper.

Plattor inkuberas över natt i luft (36 °C).

Isolering och verifiering

Kolonier som efter inkubering över natt växer på något av de använda substraten skall misstänkas vara ESBL.

Artbestämning görs enligt gängse principer.

Exempel på tre fasta substrat avsedda för påvisning av ESBL från screeningprov från feces. Till vänster och i mitten exempel på selektiva ej kromogena substrat: Delad platta (BLSE-agar (Microgen bioproducts Ltd, UK), MacConkey med cefotaxim och Drigalski med ceftazidim) och in house MacConkey med cefotaxim. Till höger kommersiell kromogen ESBL-platta (bioMerieux). Bilden visar utodlat screeningprov från feces. De misstänkta bakterierna utgjordes av E. coli och Enterobacter species. Foto; Camilla Svensson.

Fenotypisk verifiering av ESBL enligt algoritmer som anvisas i NordicAST 2012-01-01 med lappdiffusionsmetodik enligt RAF-RAFM.

Beträffande E. coli och Shigella sp. med fenotypisk misstanke om ESBL_M bör verifierande PCR enligt bilaga 1 utföras för att skilja på förvärvad-och kromosomalt medierad AmpC.

Enterobacteriaceae med fenotypisk ESBL_CARBA bör skickas till SMI för verifiering. För att snabbt identifiera en eventuell nationell smittspridning är det viktigt att alla Genotypisk diagnostik av ESBL_CARBA bör endast utföras på laboratorier som har tillräckligt många fall och därmed erfarenhet av dessa metoder. Det finns flera publicerade PCR-protokoll för de flesta av de vanliga karbapenemasvarianterna. Det är viktigt att alla nya isolat skickas till SMI för typning, oavsett om verifiering utförts på eget eller annat laboratorium, för att snabbt kunna identifiera en nationall smittspridning.

Epidemiologisk typning

Pulsfältsgelelektrofores (PFGE) är standard för epidemiologisk typning av ESBL-producerande bakterier. Alternativa metoder finns tillgängliga, däribland en kommersiell metod, rep-PCR, DiversiLab, som baserar sig på PCR amplifikation of specifika regioner mellan bakteriella sekvenser. Denna har i en studie genomförd på SMI, visats ha god upplösning bland PFGE-relaterade ESBL-isolat, men inte lika god upplösning som PFGE. En fördel med DiversiLab är att metoden är betydligt snabbare och till stor del automatiserad, inklusive tolkningssteget. En nackdel är att det inte finns någon internationell konsensus om typbeteckningar, vilket försvårar jämförelser och tolkningar på nationell och internationell nivå.

Bland alternativa metoder för epidemiologisk typning av ESBL kan nämnas MLST och MLVA.

För en detaljerad beskrivning hänvisas till SMI:s kunskapsunderlag [ESBL-producerande tarmbakterier].

Svarsrutiner

Bakterier med ESBL_A eller ESBL_M svaras ut med art följt av ESBL. ESBL_CARBA-producerande Enterobacteriaceae svaras ut med angivande av art och ESBL-typ.

Laboratorieanmälan

ESBL-producerande Enterobacteriaceae (ESBL_A och ESBL_M ) är anmälningspliktiga från laboratoriet enligt smittskyddslagen. Anmäles med angivande av art och ESBL-typ. Karbapenemas-producerande bakterier (ESBL_CARBA) skall anmälas av både laboratoriet och behandlande läkare. Smittspårningsplikt föreligger för Enterobacteriaceae med ESBL_CARBA.

Referensfunktioner

Ej beslutade

REFERENSER

• Brolund A, Wisell KT, Edquist PJ, Elfstrom L, Walder M, Giske CG. Development of a real-time SYBRGreen PCR assay for rapid detection of acquired AmpC in Enterobacteriaceae. J Microbiol Methods. 2010 Sep;82(3):229-33.
• Perez-Perez FJ, Hanson ND. Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. J Clin Microbiol. 2002 Jun;40(6):2153-62.
• Brolund A, Haeggman S, Edquist P, Gezelius L, Olsson-Liljequist B, Tegmark Wisell K, Giske C. The DiversiLab system versus pulsed-field gel electrophoresis: Characterisation of extended spectrum beta-lactamase producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. Journal of Microbiological Methods 2010;873:224-230.