Bilaga 4 Infektionsserologi och antigenpåvisning-NLI

Till innehållsförteckningen för Nedre luftvägsinfektioner inklusive mykobakteriologisk diagnostik, 2:a upplagan 2005

---

Infektionsserologi och antigenpåvisning-NLI

Mycoplasma pneumoniae

Analysprincip/Teststrategi: Ett flertal kommersiella kit finns tillgängliga för ELISA-bestämning av specifika antikroppar, i de flesta fall riktade mot P1-adhesin. Metoden anses specifik för påvisande av NLI orsakad av Mycoplasma pneumoniae.

IgM-antikroppar kan påvisas ca 1 vecka efter symtomdebut med maximala nivåer efter 2-4 veckor. Efter några månader upp till ett halvår sjunker nivåerna och blir oftast inte längre påvisbara. Vid reinfektion uteblir ofta IgM-svar. IgG-antikroppar uppträder ca 1 månad efter symtomdebut. Vid uteblivet IgM-svar kan mykoplasmainfektion verifieras genom titerförändring av IgG. Vissa tillverkare förordar påvisning av IgA-antikroppar för påvisande av infektion med mykoplasma, men värdet är oklart. IgA-antikroppar uppträder oberoende av om det rör sig om en primär- eller reinfektion.

Referensera/kontrollsera: Primär kalibrator saknas. Internkontroller för monitorering upparbetas lokalt. Lågpositiv kontroll tillverkas och bestäms till börvärde och giltighetsområde (+-2 SD) i 20 konsekutiva testkörningar.

Analysprocedur: Nedan beskrivs den antigenbaserade (P1-adhesin) VIRION/SERION ELISA classic Mycoplasma pneumoniae IgG/IgM/IgA som är ett vanligt förekommande kommersiellt alternativ. Produkten är CE-märkt enligt IVD-direktivet.

Översiktligt gäller:

• Lämpliga provtyper är serum eller plasma (EDTA, citrat, heparin). Skall inte termiskt inaktiveras. Resultaten blir osäkra om proverna är lipemiska, hemolytiska eller ikteriska.
• Prover späds i spädningsbuffert 1:100 och blandas väl.
• Prover för IgM-påvisning måste reumafaktorabsorberas enligt anvisningar (SERION-reumafaktorabsorbans, ref nr Z 200).
• Spädda och absorberade prover kan sparas i kyl i en vecka.
• Kitets kontrollsera är bruksfärdiga. Negativ och positiv kontroll inkluderas alltid.
• Antigen-coatade strips används för analysen.
• ELISA-testet genomförs enligt anvisningarna. Extinktionsmätning sker vid 405 nm inom 60 minuter efter det att stopplösning tillsatts.

Kvantitativ testutvärdering sker enligt ”4-parameter logistic-log-modell” varvid fabrikanten (Institut Virion/Serion GmbH, Würzberg, Tyskland) för varje batch fastställer standardkurva i flera testkörningar. Särskilt standardserum ingår för att bedöma testkörningens kvalitet och är av fabrikanten åsatt ett börvärde och ett giltighetsområde, se dock nedan under kvalitetssäkring.

Mätning/Kalibrering/Uträkning: I ELISA-metoden presenteras mätresultatet som ett OD-värde. Detta relateras till kitstandardens OD-värde, förutsatt att ingående kontroller inklusive internkontroll utfallit inom respektive giltighetsområde. Patientprovernas mätvärden tilldelas antikroppskoncentrationer, U/mL, genom av¬läsning i värdetabell. Gränsvärdet i IgG-testet bör ställas in så att bara ca 15 % av oselekterade blodgivare bedöms positiva (klinisk cutoff).

Kvalitetssäkring: Parade sera testas på samma strip. Internkontroll analyseras också för monitorering av eventuellt systemfel och CV %. Extern kontroll utgörs av kvalitetsutskick via EQUALIS som inkluderar IgG, IgM och IgA. Utbyte minst en gång vartannat år med två andra lab som har samma metod uppsatt.

Mätosäkerhet: Metodens inomdagsvariation (CV) bör ligga < 15 %.

Svarsrutiner: Resultatet anges som U/mL med uppgift om titerförändring.

Övrigt: För tolkningar, se i denna bok under Mycoplasma pneumoniae, referensmetodik.

Chlamydophila pneumoniae

Antikroppsbestämning mot Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae och psittaci med mikroimmunfluorescens (MIF).

MIF i dess ursprungliga form utvecklades för att bestämma antikroppar mot Chlamydia trachomatis men har senare adapterats även för C. pneumoniae och C. psittaci. Utöver in-house-metoder finns även flera kommersiella test. En utvärdering av några vanliga test har rapporterats (Bennedsen M et al. 2002) där överensstämmelsen var god.

De hos oss vanligaste, kommersiella MIF-testen är MIFA (AniLabsystems, Helsingfors, Finland) och Chlamydia MIF ( Focus Technologies, Cypress, Ca, USA).

Testet från Focus har valts eftersom de ingående antigenen alla behandlats för att avlägsna LPS som korsreagerar mellan de olika arterna. Specifik aktivitet mot C. psittaci kan därför även bedömas.

På de färdiga glasen finns grupper med tre olika antigen från chlamydia; C. pneumoniae, C. trachomatis och C. psittaci.

Dessutom finns ett negativt antigen från oinfekterade ägg.

På glasen finns 12 identiska antigengrupper. Glasen inkuberas med serumspädningar och efter tvättning med anti-human-IgG eller anti-human-IgM. Därefter sker avläsning med fluorenscensmikroskop.

Testning för IgG-ak mot C. pneumoniae/psittaci:

• 1. Serum spädes i PBS 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256 och 1/512.
• 2. 25 µL av varje serumspädning placeras på en enskild antigengrupp.
• 3. Kitets negativa och positiva kontroller liksom en ’egen’ driftskontroll i spädning testas också.
• 4. Inkuberas i fuktig kammare i 37 ºC över natten (vilket avviker från fabrikantens rekommendation).
• 5. Glasen sköljs av med PBS med 0,05 % TWEEN 20 och tvättas sedan under omrörning under 10 minuter. Avsköljs med dest.vatten och torkas.
• 6. 25 µL anti-human-IgG, fluorescensmärkt, tillsätts varje antigengrupp. Glasen inkuberas i 37 ºC i 30 minuter. Härefter tvättas glasen på nytt som ovan i 10 minuter och avsköljs slutligen med dest.vatten. Glasen får torka.
• 7. Monteras med 90 %-ig buffrad glycerol eller särskild monteringsvätska som ingår i kitet.
• 8. Glasen avläses med fluorescensmikroskop vid 250 – 300 gångers förstoring. Varje antigen bedöms. En mängd likstora grönlysande organismer kan iakttas vid positiv reaktion. Denna reaktion avtar gradvis i högre spädning. Slutligen kan lysande organismer endast observeras i kanten av antigenpricken. Provets antikroppstiter anges som det inversa spädningsteg då central uppklarning inträffat men perifer fluorescens fortfarande är klar och tydlig. Endast randfluorescens bör bedömas som negativt.

Testning för IgM-antikroppar mot C. pneumoniae/psittaci:

• 1. Serum screenas i spädning 1/16 och 1/64 för IgM-anitkroppar.
• 2. Positiva sera IgG-absorberas med Gullsorb (Gull laboratories,inc. Salt Lake City, USA).
• 3. Serumspädning i PBS görs därefter enl. följande: 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 och 1/640.
• 4. Kitets kontroller liksom en ’egen’ driftkontroll medtages.
• 5. Glasen inkuberas över natten som ovan.
• 6. Sköljes och tvättas som ovan samt torkas.
• 7. Anti-human-IgM, fluorescensmärkt, tillsätts sedan och glasen inkuberas i 30 minuter vid 37º C.
• 8. Efter tvättning och torkning monteras glasen som ovan och avläses i fluorescensmikroskop vid 250 – 300 gångers förstoring.

Kvalitetskontroll: Eftersom olika MIF-tester används av olika laboratorier och då någon enskild test inte verkar vara överlägen andra, blir extern kvalitetskontroll betydelsefull för att försöka ensa resultaten. I Sverige finns årligen återkommande kvalitetsutskick via EQUALIS AB. Diagnostik av akut infektion av C. pneumoniae prövas då i parade eller enskilda sera. Resultaten från dessa paneler visar att akut infektion av C. pneumoniae regelmässigt påvisas av deltagande laboratorier i parade eller enskilda sera. Specifikt IgM skiljs också från störande reumafaktorer. (Även EIA-metoder klarar dessa paneler).

Eftersom ett standardserum med fastställd titer inte finns tillgängligt har inget försök gjorts att ensa erhållna titrar.

REFERENS

• Bennedsen M, Berthelsen L, Lind I. 2002. Performance of three microimmunofluorescence assays for detection of Chlamydia pneumoniae immunoglobulin M, G, and A antibodies.Clin Diagn Lab Immunol. 9: 833-9.

Bordetella pertussis

Analysprincip/Teststrategi: Indirekt ELISA för antikroppar mot pertussistoxin (anti-PT) betraktas som specifik för påvisande av pertussisinfektion. Serokonversion i antikroppskoncentration mot filamentöst hemagglutinin (anti-FHA) förekommer också efter infektion med B. parapertussis och okapslade Haemophilus influenzae. Anti-FHA motiveras av att kinetiken skiljer sig. Anti-PT kommer tidigt och når snabbt en platå hos immuniserade medan anti-FHA visar en längre period av antikroppsstegring, vilket rätt utnyttjat kan öka sensitiviteten i systemet. Kombinationen anti-FHA stegring och hög men stabil anti-PT talar för pertussis.

Nästan alla fall med IgA-svar visar samtidig IgG-stegring. Eftersom en nedgång för IgA anti-PT kan komma snabbare än för IgG anti-PT ökas dock sensitiviteten om även IgA inkluderas.

Användning av pertaktin och fimbrier ger ingen ökad sensitivitet men kan medföra specificitetsproblem. Referenssera/Kontrollsera: Primär kalibrator är Humant antiserum HRP3 (Food and Drug Administration, USA) med 200 arb.EU/mL för IgG anti-PT, 200 arb.EU/mL för IgG anti-FHA och 15 arb.EU/mL för IgA anti-PT (Lynn et al 1996).

Angiven primärkalibrator är för närvarande svårtillgänglig. Sekundär kalibrator SBL IgG 42 kan också användas. Internkontroller för monitorering upparbetas lokalt.

Reagens/Analysprocedur: Antigen har tillhandahållits av vaccintillverkarna. Mätningen utförs i 8 spädningssteg för såväl kalibrator som test- och kontrollsera. Singel point kan användas i större serier men då förloras den information som kurvans lutning ger. Coatningsdos, bovint serumalbumin , konjugat och buffertar är kritiska för jämförbarhet och måste utprövas lokalt. Mätning/Kalibrering/Uträkning: I ELISA-metoden presenteras mätresultatet som ett OD-värde. För att uppnå spårbarhet relateras provets uppmätta OD-värde till kalibratorns OD-värde. Kalkylering av arbiträra enheter (arb.EU/mL) från kalibratorn kan ske på många olika sätt. I detta fall används ”reference line calculation method” (Reizenstein et al.1995) som är ett sätt att mäta det horisontella avståndet mellan kalibratorns lutningskurva och en parallellt dragen dosresponskurva representerande provets mätpunkter.

Kvalitetssäkring: Parade testsera analyseras på samma platta. Vid sidan av kalibratorn analyseras också på samma platta en internkontroll för monitorering av såväl bias som imprecision (CV %). Vid diagnostik används en kontroll med mätvärden centralt i mätintervallet; för immunitetsstudier dessutom en nära mätområdets nedre cutoff. Värdena införs kontinuerligt i Shewhartdiagram. Acceptanskriterier skall finnas upprättade.

Mätosäkerhet: Metodens inomdagsvariation (CV) är efter omtestningar <15 %.

Mätintervall: För diagnostiskt ändamål 12-600 EU/mL. Inom detta mätområde är CV % stabil.

Övriga prestanda: PT-antikroppar anses specifika för infektion med B. pertussis. För att en titerstegring skall betraktas som säkerställd skall konvalescentserum uppnå undre gränsen för mätintervallet. Inom mätintervallet kan under givna förutsättningar en titerstegring på 50 % anses som signifikant.

Svarsrutiner: Resultatet anges som arb.IgG/IgA ELISA-enheter (EU/mL) med uppgift om titerförändring.

REFERENSER

• Lynn, F., G.F. Reed, and B.D. Meade. 1996. Collaborative study for the evaluation of Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assays used to measure human antibodies to Bordetella pertussis antigens. Clin. and Diagn. Lab. Immunol. 3:689-700.

• Reizenstein, E., H.O. Hallander, W.C. Blackwelder, I. Kuhn, M. Ljungmann, and R. Möllby. 1995. Comparison of five calculation modes for antibody ELISA using pertussis serology as a model. J. Immunol. Methods 183:279-290.

Legionella pneumophila

Analysprincip/teststrategi: Legionellabakterier av olika serotyper och arter fästs till objektglas. Patientserum sätts till glasen och om serum innehåller antikroppar (Ak) riktade mot Legionella binder dessa till bakterierna. Därefter tillsätts FITC-märkta antikroppar specifika för humant immunglobulin. Glasen tvättas och monteras och avläses i UV-mikroskop. Om antikroppar mot Legionella finns i patientens serum fluorescerar bakterierna.

Antigen för att med indirekt immunfluorescens påvisa antikroppar mot Legionella.

Värmeavdödat helcellsantigen fixeras på objektglas.

Avdelningen för klinisk mikrobiologi vid akademiska laboratoriet, Akademiska sjukhuset i Uppsala upprätthåller referensmetod för legionellaserologi.

Initialt testas patientsera mot 4 olika bakteriepooler.

• Pool 1 L. pneumophila serogrupp 2-8.
• Pool 2 L. longbeachae serogrupp 1 och serotyp 2, L. micdadei och L. bozemanii.
• Pool 4 L. pneumophila serogrupp 1, subgrupper Philadelphia och Knoxville.
• Pool 5 L. pneumophila serogrupp 1, subgrupper Olda och Bellingham.

Om initial titer >=1/32 titreras vidare mot enskilda antigener.

Mätning/kalibrering/uträkning:

• Fluorescensen graderas +, ++, +++.
  • +++ = Starkt lysande grön fluorescens med tydlig bakteriemorfologi.
  • ++ = Lysande grön fluorescens med klar bakteriemorfologi.
  • + = Svagare grön fluorescens men fortfarande tydlig bakteriemorfologi.

Den högsta spädning som ger tydlig ++ fluorescens anges som titervärde.

Kvalitetsäkring

Intern kontroll: poolat patientserum används för att följa metodvariationen. Artspecifika kontrollsera används för att kontrollera att antigenen på glasen är de rätta.

Extern kontroll: Kvalitetsutskick via hänvisningslab, panelutbyte med andra laboratorier (dock begränsade möjligheter eftersom endast ett fåtal laboratorier har metoden uppsatt).

Mätosäkerhet: +/- 1 titersteg.

Prestanda

En titerändring kan ta flera veckor och är ibland ej möjlig att med säkerhet påvisa. IgM kan ibland påvisas tidigt i förloppet, å andra sidan kan dessa antikroppar kvarstå under lång tid varför fyndet ej är helt pålitligt. Sensitiviteten har beräknats till 60-80 %, och specificiteten vid infektioner orsakade av Legionella pneumophila sg 1 till ca 95 %. Serologi anses mer opålitlig när infektion orsakas av Legionella pneumophila ej-sg 1. För säker diagnos krävs parad serologi med 4-faldig titerförändring. Enstaka höga titrar kan vara av värde i samband med utredning vid misstänkt utbrott. Serologi är dock den enda metod som kan användas för diagnos av Pontiac-feber eftersom odlingsfynden då är negativa.

Maximalt Ak-svar ses vanligen inom 4-5 veckor efter sjukdomsdebut. 10 % svarar med påvisbara Ak-nivåer först efter > 6 veckors sjukdomsduration. I samband med utbrottet i Värnamo 1991 (Darelid) noterades att hos 17 av 21 (81 %) kunde en 4-faldig titersänkning noteras inom 12 månader. Uteblivet Ak-svar eller lågt Ak-svar 32 påvisades hos 9/52 (17 %) av patienterna. Titrar kan kvarstå upp till 2 år.

Korsreaktioner vid infektioner med andra gramnegativa bakterier kan ske t.ex. Bacteroides fragilis, Citrobacter, Campylobacter och Pseudomonas. Även Coxiella burnetii kan orsaka korsreaktion.

Svarsrutiner

Negativt prov svaras: Antikroppar mot Legionella med indirekt IF < 1/32.

Prov med låga titrar besvaras: Antikroppar mot Legionella i pool …påvisade i titer 1/32 (poolens innehåll anges på svaret). Prov innehållande högre titrar besvaras: Antikroppar mot Legionella- (artnamn och serotyp) påvisade i titer….

Metoder för påvisning av antikroppar i serum har ett begränsat värde för akutdiagnostiken eftersom titerförändringar mellan två prov sällan kan påvisas tidigt. IgM-antikroppar kan dock påvisas i tidigt skede efter symtomdebuten. Serologisk provtagning är också viktig vid uppföljning av misstänkta fall vilket då underlättas av att serumprov tagits i akutskedet. Vid serokonversion är sensitiviteten måttlig (ca 0,75) men specificiteten relativt god, >0,95. Enstaka höga titrar kan tala för aktuell sjukdom, särskilt om det samtidigt förekommer andra säkerställda fall i omgivningen. Serologisk diagnostik är nöjaktigt utvärderad endast för infektioner orsakade av L. pneumophila serogrupp 1. Resultat av antikroppstitreringar mot andra serogrupper och legionellaarter är därför mindre tillförlitliga.

Påvisande av Legionella pneumophila serogrupp 1-antigen i urin

Analysprincip/teststrategi: Kommersiella kit finns tillgängliga. Utsöndringen av legionellaantigen i urin kan variera beroende på den individuella patienten, den underliggande sjukdomen och ev. behandling. Utsöndring av antigen kan påvisas från 3 dagar efter symtomdebut och i vissa fall vid defekt cellmedierad immunitet kvarstå upp emot 1 år efter genomgången infektion.

Referenssera / kontrollsera: Primär kalibrator saknas. Internkontroller för monitorering upparbetas lokalt. Lågpositiv kontroll tillverkas och bestäms till börvärde och giltighetsområde (+- 2 SD) i 20 konsekutiva testkörningar. Analysprocedur: Nedan beskrivs Legionella urinary antigen EIA binax. Produkten är CE-märkt enligt IVD-direktiv. Metoden bygger på ELISA-metodik och påvisar samt kvantifierar mängden antigen från Legionella pneumophila serogrupp 1 i urinen hos infekterade patienter. Urin sätts till mikrotiterplattor klädda med polyklonala kaninantikroppar specifika för L. pneumophila serogrupp 1-antigen. Anti-Legionella-HRP-konjugat tillsätts samtidigt som provet. Efter inkubation och efterföljande tvättning tillsätts enzymsubstrat och färgomslag mäts i fotometer. Översiktligt gäller: Testet har endast validerats för urin. Övriga provmaterial (plasma, serum eller andra kroppsvätskor) som kan innehålla legionellaantigen har inte utvärderats.

Alla reagens skall vid användandet vara rumstempererade.

Kontrollera att det inte finns kristaller i tvättvätskan. I så fall kan den värmas i 37 °C i 5 minuter.

Tvättsteget är kritiskt. Otillräcklig tvätt kan orsaka felaktigt resultat. Om absorbansen på den negativa kontrollen är >0,100 U måste man tvätta ytterligare tills absorbansen är <0,100 U.

ELISA-testet genomförs enligt anvisningarna. Läs av absorbansen vid 450 nm.

Vid tveksamt positiva resultat eller vid resultat på gränsvärdenivå kan specificiteten kontrolleras med kokning av urinen i 10 minuter (vissa laboratorier testar om alla positiva prov efter kokning).

Mätning/Kalibrering/Uträkning: Blankens absorbansvärde subtraheras från absorbansen på varje övrig brunn. Medelvärdena av varje dubbelprov beräknas. Räkna sedan ut ett index enligt följande formel (använd medelvärden av dubbel¬proven):

• Index = OD positiv kontroll eller OD patientprov
• OD negativ kontroll

Ett typiskt positivt resultat kan se ut så här:

• 0,300 (OD) = index 7,5
• 0,040 (OD)

Kvalitetssäkring: Internkontroll analyseras vid varje analys för monitorering av eventuellt systemfel och CV%. Utbyte bör ske 2 gånger årligen med två andra laboratorier. The European Working Group for Legionella Infections (EWGLI) erbjuder ett begränsat kvalitetssäkringsprogram där olika länders hänvisningslaboratorier kan delta. I Sverige deltar de mikrobiologiska laboratorierna vid Akademiska sjukhuset och Karolinska.

Prestanda: Metoden upptäcker bara antigen från Legionella pneumophila serogrupp 1. Enligt tillverkaren är sensitiviteten 97,7% och specificiteten 100% (1). Det finns dock undersökningar som visar att andra t.ex. serogrupp 4 och 6 i vissa fall kan ge reaktivitet i snarlik test (2).

Mätintervall

• OD 0,000 – 3,000.

• Svarsrutin inklusive referensintervall
  • Prov med index > 4,0 besvaras: Positiv (svaras med beräknat indexvärde)
  • Prov med index < 2,0 besvaras: Negativ
  • Prov med index = 2-4 besvaras: Gränsvärde

Positiva prov telefonbesvaras.

Det immunkromatografiska kitet (binax NOW) som är lättare att hantera praktiskt har uppvisat jämförbara resultat med binax EIA. Även andra fabrikat finns tillgängliga.

Anmärkning: Positivt fynd skall anmälas enligt smittskyddslagen.

REFERENSER

• Produktblad till Legionella Urinary Antigen, Binax.
  • Kohler R., Wheat J., French M., Meenhorst P., Winn W., Edelstein P. 1985. Cross- reactive urinary antigens among patients infected with Legionella pneumophila sergroups 1 and 4 and the Leiden 1 strain. J Infect Dis. 152: 1007-1012.
• Yzerman PF, den Boer JW, Lettinga KD, Schellekens J, Dankert J, Peeters M. 2002. Sensitivity of three urinary antigen tests associated with clinical severity in a large outbreak of legionnaires´ disease in the Netherlands. 40: 3232-3236.

Påvisande av S. pneumoniae antigen i urin (ej referensmetodik)

Bakgrund: Ett nyutvecklat immunokromatografiskt test (ICT) för snabb identifiering av pneumokock C-polysackarid (PnC, cellväggsantigen) i urinprov har visats ha hög känslighet för detektion av pneumokockinfektion i lungorna. Metoden har högre känslighet än påvisande av pneumokockantigen i urin med EIA, motströmselfores eller latexagglutination. Testet är avsett att användas som ett snabbdiagnostiskt komplement till de konventionella diagnostiska metoder som beskrivs i denna bok. Ett positivt testresultat med ICT anses korrelera väl till sjukdom hos vuxna. Hos barn finns risk för genomslag av koloniserande flora i övre luftvägarna. Förekomst av PnC i urin korrelerar inte till bakteremi.

Referensmaterial: Primär kalibrator saknas. Positiv internkontroll tillverkas lokalt genom att späda positiv patienturin 1:100. Kontrollen förvaras fryst i –20 ºC. Negativ internkontroll tillverkas på motsvarande sätt. Utbyte av positiv kontroll bör ske årligen med två andra laboratorier.

Analysprocedur: Nedan beskrivs ICT, Binax NOW Streptococcus pneumoniae urinary antigen test som är godkänt av FDA och CE-märkt enligt IVD-direktivet.

Kanin IgG-antikroppar mot PnC och get-anti-kanin IgG-antikroppar (kontroll) är adsoberade (immobiliserade) på varsin linje på ett nitrocellulosamembran (strip). Ytterligare kanin anti-PnC-antikroppar konjugerade till kolloidala guldpartiklar är adsorberade till ett fibröst stroma som är anslutet till membranet.

Analysen utförs enligt fabrikantens anvisningar. I korthet sätts urinprovet till stromat via medföljande fiberarmerad provtagningspinne. Buffertlösning (citrat/fosfat buffert med NA-laurylsulfat, Tween 20 och Na-azid) tillsätts för att lösa ut provet från pinnen varvid detta sprids över membranet.

Avläsning: Guldpartikel-konjugatet binder befintliga PnC i provet till ett antigen-antikroppskomplex som i sin tur binds till de immobiliserade anti-PnC-antikropparna i membranet varvid en rosafärgad linje framträder.

De immobiliserade get-anti-kanin-IgG antikropparna i membranet binder överskottet av konjugerade antikroppar varvid befintlig blå linje blir rosafärgad.

Resultatet bedöms som positivt om två rosa linjer enligt ovan uppträder inom 15 minuter. Om bara kontrollinjen uppträder bedöms provet som negativt. Resultatet är ogiltigt om kontrollinjen bibehåller sin ursprungliga blåa färg.

I tveksamma fall anger tillverkaren att förnyad avläsning kan ske upp till en timme efter provapplikation.

Mätning/uträkning: Ej aktuellt.

Kvalitetssäkring: Med kitet följer positiv kontroll (värmeinaktiverade pneumokocker) och negativ dito på fiberarmerad pinne. Vi rekommenderar dock att interna kontroller används vid såväl batchkontroll som fortlöpande testkontroll.

Prestanda: Analytisk sensitivitet: Det anges av tillverkaren att testet upptäcker flertalet relevanta pneumokockserotyper; således har det visats ge positivt resultat för 23 serotyper av S. pneumoniae i koncentration 10e5 CFU/mL. Uppges tåla spädning av positiv patienturin upp till 1:200, dock vid ospecificerad mängd antigen. Analytisk specificitet: Korsreaktivitet föreligger med antigen från S. oralis och S. mitis.

Diagnostisk sensitivitet anges till drygt 80 % av tillverkaren. I en undersökning av Kanavaki et al, 2002, var testet positivt i 14 av 66 fall av samhällsförvärvad pneumoni hos vuxna. Motsvarande sputumodling var positiv för pneumokocker i endast 2 fall och blododling i endast 1 fall.

Diagnostisk specificitet anges till 97,2 % baserat på kliniska studier av samhällsförvärvad pneumoni liksom undersökning av urin hos friska personer. Detaljerad listning beträffande klinisk korsreaktivitet finns i produktinstruktionerna.

Svarsrutin: Positivt test kan besvaras: Direktpåvisning av pneumokockantigen i urin: Positiv.

REFERENS

• Kanavaki, S., Karabela, S., Makarona, M., Triantafillou, S., Efstathiadou, E. and Faviou, E. 2002. Alternative microbiological methods for the diagnosis of pneumococcal pneumonia. Pneumon. 15;196-201.

Direkt immunfluorescens; virologiska agens

En direkt immunfluorescensmetod för antigenpåvisning av virologiska agens i infekterade celler från luftvägarna.

Analysprincip: Antigenpåvisning med direkt immunfluorescens (IF)-teknik. Kvalitativ test för påvisning av virologiska agens i celler från luftvägar med hjälp av antikroppar. Reagens och kontroller: Reagens innehåller antikroppar konjugerade till ett fluorescerande ämne.

Kontroller utgörs av fixerade infekterade resp. oinfekterade celler.

• Utförande
  • 1. Centrifugera inskickat nasofarynxaspirat i rumstemperatur 10 min 380 g = 1500 RPM. Vid liten provmängd kan aspiratet spädas i PBS till ca 2,5 mL.
  • 2. Tillsätt 5-10 mL PBS till röret med pelleten, avlägsna slemklumpar och centrifugera 10 min 380 g = 1500 RPM. Sug av och kasta överfasen.
  • 3. Suspendera cellpelleten i ca 200 μL PBS och överför en droppe suspension med engångspipett till märkta objektsglas.
  • 4. Lufttorka preparaten, ca 2 minuter.
  • 5. Fixera i aceton 10 minuter.
  • 6. Låt preparaten lufttorka. Preparaten är nu klara.
  • 7. Tag ut monoklonala antikroppar och monteringsvätska ur kylen så att de hinner anta rumstemperatur innan de används för färgning.
  • 8. Lägg glasen i en fuktig kammare.
  • 9. Färga glasen med konjugerade monoklonala antikroppar.
  • 10. Inkubera, i den fuktiga kammaren, 15 minuter i termostat, 34 ºC-38 ºC.
  • 11. Skölj glasen genom att hälla PBS i petriskålen. Låt glasen ligga 2 minuter. Häll av PBS och upprepa proceduren. Låt glasen lufttorka.
  • 12. Montera glasen med monteringsvätska och med täckglas.
  • 13. Läs av glasen i fluroscensmikroskop.

Bedömning: Avläsning sker i fluorescensmikroskop vid 200x och /eller 400x förstoring. Hela cellmattan avläses.

Endast erfaren personal avläser och bedömer IF-färgade preparat. För PÅVISAT resultat räcker det att en typiskt färgad cell identifieras. För ej påvisat resultat krävs inspektion av minst 50 st negativa celler.

Kvalitetssäkring: Deltagande i externa kvalitetskontrollprogram.

Mätosäkerhet: Känsligheten är avhängig av flera parametrer bl. a. provtagningsmtetodik, provglasets kvalitet samt när i sjukdomsförloppet provtagningen sker. Således kan sensitiviteten uppskattningsvis variera mellan 60-100 %.