Skillnad mellan versioner av "Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker"

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
Rad 13: Rad 13:
 
För varje bakterieart måste PFGE-metoden optimeras. En av nackdelarna med PFGE är att resultaten inte är numeriska och därmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier. Internationellt accepterade metoder för PFGE som tillåter jämförelser av  bakterieisolat i olika länder finns bara för ett fåtal bakteriearter, däribland MRSA.  
 
För varje bakterieart måste PFGE-metoden optimeras. En av nackdelarna med PFGE är att resultaten inte är numeriska och därmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier. Internationellt accepterade metoder för PFGE som tillåter jämförelser av  bakterieisolat i olika länder finns bara för ett fåtal bakteriearter, däribland MRSA.  
  
−
Nedan beskrivs som exempel på PFGE-analys en klassisk metod för MRSA.
+
Nedan beskrivs översiktligt en klassisk metod för MRSA som exempel på PFGE-analys.
  
 
===Indikation===
 
===Indikation===
Rad 22: Rad 22:
  
 
===Analysprincip===
 
===Analysprincip===
−
PFGE baserar sig på att med ''restriktionsenzymer'' klyva bakteriens DNA och därefter separera DNA-fragmenten med elektrofores i en agarosgel. Bandmönstret i gelen analyseras sedan. Det är helt avgörande att utgå ifrån intakt DNA (hela DNA-molekylen), innan klyvning sker med lämpligt  restriktionsenzym. För stafylokocker, liksom för VRE, används  restriktionsenzymet ''SmaI''.  Efter avslutad elektrofores färgas gelen  för att visualisera banden av  DNA-fragment av olika storlek  (PFGE-mönster) och avfotograferas. Resultatet databehandlas för att  identifiera likheter och olikheter mellan isolaten. Bakterieisolat av  samma ursprung har samma PFGE-mönster och får därmed samma beteckning.
+
PFGE baserar sig på att med ''restriktionsenzymer'' klyva bakteriens DNA och därefter separera DNA-fragmenten med elektrofores i en agarosgel. Bandmönstret i gelen analyseras sedan. Det är helt avgörande att utgå ifrån intakt DNA (hela DNA-molekylen), innan klyvning sker med lämpligt  restriktionsenzym. För stafylokocker, liksom för VRE, används  restriktionsenzymet ''SmaI''.  
  
−
Apparatur
+
Efter avslutad elektrofores färgas gelen  för att visualisera banden av DNA-fragment av olika storlek (PFGE-mönster) och avfotograferas. Resultatet databehandlas för att  identifiera likheter och olikheter mellan isolaten. Bakterieisolat av  samma ursprung har samma PFGE-mönster och får därmed samma beteckning.
−
Termostat 37 och 55°C
+
 
−
Centrifug ≤ 12.000 x g
+
====Apparatur, förbrukningsmaterial och reagens====
−
Pipett 1-10 µl
+
*För analysen  behövs Elektroforesutrustning för PFGE och UV-bord med kamera
−
Pipett 1-40 µl
+
*Referensstam ''S. aureus'' NCTC 8325
−
Pipett 40-200 µl
+
*Gjutformar till agarospluggar
−
Pipett 200-1000 µl
+
*Huvudsakliga reagens utgörs av LMT agaros (i EC buffert) FMC Bioproducts, Lysostaphin, Proteinase K, TEN-buffert (Tris HCl, EDTA, NaCl), EC-buffert (Trizma Hydroklorid, NaCl, Etylendiamintetraättiksyra, Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter, N-Lauryl-sarcosin, natriumdeoxycholat, Dest vatten, Ph justerat till 7,5).
−
Elektroforesutrustning för PFGE
+
*TE-buffert:(Tris HCl pH 7,6, EDTA), 10x TBE buffert (Trizma base, Borsyra H3BO3, Titriplex III (Na-EDTA), Dest vatten)
−
UV-bord med kamera
+
*Ultra pure TM agarose Invitrogen
−
Våg 300/3000 g
+
*Restriktionsenzym Sma 1 med buffert
−
Våg 1 mg- 160 g
+
*Gel Red
 
   
 
   
−
Förbrukningsmateriel och reagens
+
====Analyspocedur====
−
Ref stam NCTC 8325
 
−
McFarlandrör nr 4
 
−
13 ml polypropylenrör
 
−
Engångsplatinös
 
−
1,5 ml centrifugrör
 
−
Engångstippar till ovanstående pipetter
 
−
Skalpell
 
−
Spatlar
 
−
Petriskål
 
−
Gjutformar till agarospluggar
 
−
Dubbeldetsillerat DNAse och RNAse fritt vatten
 
−
1M Tris HCl pH 7,5
 
−
5 M NaCl
 
−
0,5 M EDTA pH 8,0
 
−
LMT agaros (2% I EC buffert) FMC Bioproducts
 
−
Lysostaphin 1 mg/ml i 0,05 M Tris HCl (pH 7,5)
 
−
0,15 M NaCl
 
−
Proteinase K (5mg/ml I d.d. sterilt vatten)
 
 
   
 
   
−
TEN-buffert: 100 mM Tris HCl pH 7,5
+
*''DNA-extraktion:'' Övernattkultur på agarplatta slammas i TEN-buffert (109 bakt/mL). Efter centrifugering resuspenseras bakterierna i EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min varefter 2% LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert tillsätts tillsammans med Lysostaphin. Agarosen gjuts i pluggformar med hjälp av pipett som får stelna i kylskåp.  
−
                      100 mM EDTA
+
 
−
                      150 mM NaCl
+
Pluggarna delas med skalpell i tre delar och till två av bitarna överförda till ett rör tillsätts TE-buffert samt proteinase K. Inkuberas i 55°C. TE-bufferten avlägsnas varefter ny kylskåpskall buffert tillsätts repetitivt 4-5 gånger.  
−
+
*'''Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma 1'''
−
EC-buffert:  Trizma Hydroklorid 0,95 g
 
−
                      NaCl 58,4g
 
−
Etylendiamintetraättiksyra 29,2 g
 
−
Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter 5 g
 
−
N-Lauryl-sarcosin 5 g
 
−
Natriumdeoxycholat 2 g
 
−
Dest vatten ca 800 ml
 
−
Ph justeras med ca 50 ml 5 M NaOH till 7,5
 
−
 
−
TE-buffert:   10  mM Tris HCl pH 7,6
 
−
1mM EDTA
 
−
                     
 
−
 
−
10x TBE buffert:
 
−
Trizma base 108 g
 
−
                      Borsyra H3BO3 55,65 g
 
−
                      Titriplex III (Na-EDTA) 7,44 g
 
−
                      Dest vatten till 1000 ml
 
−
 
−
Ultra pure TM agarose Invitrogen
 
−
Restriktionsenzym Sma 1 med buffert
 
−
Gel Red
 
−
 
−
Analyspocedur
 
−
 
−
DNA extraktion
 
−
 
−
Över      natt kultur bakterier på agarplatta slammas i 500 µl TEN-buffert till      täthet 1x 109 bakt/ml i centrifugrör, centrifugeras 10 sek x 7000      x g, dekanteras och resuspenderas i 125 µl EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min.Tillsätt      125 µl 55°C      2% LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert. Tillsätt 12 µl 1 mg/ml lysostaphin,      blanda väl genom att pipettera upp o ner några gånger och gjut agarosen i     pluggformar med hjälp av pipett.Låt      pluggarna stelna i +4°C      10-15 min.Placera      pluggarna från respektive isolat i ett centrifugrör. Oftast gjuts två      pluggar /isolat, med 1 ml EC-buffert och inkubera i 37°C.Dela      en av pluggarna med skalpell i tre delar. Två av bitarna överförs till     nytt rör och 250 µl TE-buffert samt 25 µl proteinase K (5 mg/ml)      tillsätts. Inkubera 1 timma 55°C.Avlägsna      bufferten och tillsätt ny kylskåpskall TE-buffert och detta upprepas 4-5     ggr med 10 min mellanrum. Förvara pluggarna i kyl mellan tvättarna.      Pluggarna kan sparas i kyl i 4 °C någon vecka.
 
−
 
−
Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma 1
 
−
 
−
1. Späd buffert (10 μl reaktionsbuffert + 90 μl dest.vatten per isolat).
 
−
2. Tillsätt 100 μl av ovanstående buffert till varje centrifugrör.
 
−
3. Tillsätt 1 μl enzym (= 1Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt.
 
−
4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret.
 
−
5. Blanda försiktigt och inkubera i 15 minuter vid 37°C.
 
−
6. De digererade pluggarana kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.
 
 
   
 
   
−
Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet
+
**1. Späd buffert (10 μl reaktionsbuffert + 90 μl dest.vatten per isolat).
−
1. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 ml 0,5 x TBE-buffert
+
**2. Tillsätt 100 μL buffert till varje centrifugrör.
−
2. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim.
+
**3. Tillsätt 1 μL Sma 1-enzym (= 1 Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt.
−
3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen. Om gel med 15 brunnar används placeras klyvningar från referensstammen lämpligen i brunn nr 2, 8 och 14.
+
**4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret.
 +
**5. Blanda och inkubera i 15 minuter vid 37°C.
 +
**6. De digererade pluggarna kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.
 
   
 
   
−
4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 l vatten.)
+
*'''Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet'''
−
5. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta.
+
**1. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 mL 0,5 x TBE-buffert
−
6. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C.  
+
**2. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim.
−
7. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp.  
+
**3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen.
−
8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Banden analyseras.
+
**4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 L vatten.)
 +
**5. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta.
 +
**6. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C.  
 +
**7. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp.  
 +
**8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Banden analyseras.
 +
====Analys av bandmönster====
 +
==REFERENSER==
 
[[Kategori:Molekylärbiologisk diagnostik]]
 
[[Kategori:Molekylärbiologisk diagnostik]]
−
[[KAtegori:Smittskyddslagens sjukdomar]]
+
[[Kategori:Smittskyddslagens sjukdomar]]

Versionen från 2 april 2012 kl. 18.24

Artikel under utarbetande april 2012. Innehållet är preliminärt i väntan på konsensusförfarande

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik

och

falldefinitionen [[]]

Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker

Bakgrund

Pulsfältgelelektrofores (PFGE) är en av de äldsta metoder för epidemiologisk som fortfarande är i bruk för att jämföra bakterieisolat då misstanke om smittspridning finns. PFGE används sedan 1990-talet och intar en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer. Metoden var länge standard för typningen av meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA), men används idag huvudsakligen som en av de mest diskriminerande typningsmetoderna vid utbrott med VRE, invasiva pneumokocker och olika arter av Enterobacteriaceae. För att säkrare kunna kartlägga ett utbrott med MRSA, framförallt med de vanligaste Spa-typerna, kan komplettering med PFGE vara användbar.

För varje bakterieart måste PFGE-metoden optimeras. En av nackdelarna med PFGE är att resultaten inte är numeriska och därmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier. Internationellt accepterade metoder för PFGE som tillåter jämförelser av bakterieisolat i olika länder finns bara för ett fåtal bakteriearter, däribland MRSA.

Nedan beskrivs översiktligt en klassisk metod för MRSA som exempel på PFGE-analys.

Indikation

För att i epidemiologiskt utredningssyfte jämföra olika isolat av MRSA.

Provmaterial

Renkultur av stafylocker på agarplatta.

Analysprincip

PFGE baserar sig på att med restriktionsenzymer klyva bakteriens DNA och därefter separera DNA-fragmenten med elektrofores i en agarosgel. Bandmönstret i gelen analyseras sedan. Det är helt avgörande att utgå ifrån intakt DNA (hela DNA-molekylen), innan klyvning sker med lämpligt restriktionsenzym. För stafylokocker, liksom för VRE, används restriktionsenzymet SmaI.

Efter avslutad elektrofores färgas gelen för att visualisera banden av DNA-fragment av olika storlek (PFGE-mönster) och avfotograferas. Resultatet databehandlas för att identifiera likheter och olikheter mellan isolaten. Bakterieisolat av samma ursprung har samma PFGE-mönster och får därmed samma beteckning.

Apparatur, förbrukningsmaterial och reagens

  • För analysen behövs Elektroforesutrustning för PFGE och UV-bord med kamera
  • Referensstam S. aureus NCTC 8325
  • Gjutformar till agarospluggar
  • Huvudsakliga reagens utgörs av LMT agaros (i EC buffert) FMC Bioproducts, Lysostaphin, Proteinase K, TEN-buffert (Tris HCl, EDTA, NaCl), EC-buffert (Trizma Hydroklorid, NaCl, Etylendiamintetraättiksyra, Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter, N-Lauryl-sarcosin, natriumdeoxycholat, Dest vatten, Ph justerat till 7,5).
  • TE-buffert:(Tris HCl pH 7,6, EDTA), 10x TBE buffert (Trizma base, Borsyra H3BO3, Titriplex III (Na-EDTA), Dest vatten)
  • Ultra pure TM agarose Invitrogen
  • Restriktionsenzym Sma 1 med buffert
  • Gel Red

Analyspocedur

  • DNA-extraktion: Övernattkultur på agarplatta slammas i TEN-buffert (109 bakt/mL). Efter centrifugering resuspenseras bakterierna i EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min varefter 2% LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert tillsätts tillsammans med Lysostaphin. Agarosen gjuts i pluggformar med hjälp av pipett som får stelna i kylskåp.

Pluggarna delas med skalpell i tre delar och till två av bitarna överförda till ett rör tillsätts TE-buffert samt proteinase K. Inkuberas i 55°C. TE-bufferten avlägsnas varefter ny kylskåpskall buffert tillsätts repetitivt 4-5 gånger.

  • Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma 1
    • 1. Späd buffert (10 μl reaktionsbuffert + 90 μl dest.vatten per isolat).
    • 2. Tillsätt 100 μL buffert till varje centrifugrör.
    • 3. Tillsätt 1 μL Sma 1-enzym (= 1 Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt.
    • 4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret.
    • 5. Blanda och inkubera i 15 minuter vid 37°C.
    • 6. De digererade pluggarna kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.
  • Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet
    • 1. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 mL 0,5 x TBE-buffert
    • 2. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim.
    • 3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen.
    • 4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 L vatten.)
    • 5. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta.
    • 6. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C.
    • 7. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp.
    • 8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Banden analyseras.

Analys av bandmönster

REFERENSER

Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=Pulsfältgelelektrofores_(PFGE)_av_meticillinresistenta_stafylokocker&oldid=9097"