Bilaga 6. Parasitologiska metoder

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

---

Bilaga 6 A.

Mikroskopisk påvisning av cystor och maskägg efter formalin/etylacetat koncentration av feces

Se länk PAR 01

Bilaga 6 B.

Mikroskopisk påvisning av Cryptosporidium, Cyclospora och Isosporaoocystor efter färgning med modifierad Ziehl-Neelsen

Se länk PAR 02

Bilaga 6 C.

Mikroskopisk påvisning av trofozoiter efter trikrom-färgning

Se länk PAR 03

Bilaga 6 D.

Mikroskopisk påvisning av microsporidiasporer efter förstärkt trikromfärgning

Analysprincip

Mikroskopisk påvisning av microsporidiasporer. Lufttorkade preparat fixeras med metanol, infärgas med modifierad trikromfärg, avfärgas och dehydreras. Avläsning sker i ljusmikroskop. Sporerna färgas rosa mot en blå bakgrund.

• Apparatur
  • centrifug
  • dragskåp
  • automatpipett 10 - 50 µL
  • ljusmikroskop med kalibrerat mätokular
  • immersionsobjektiv 100x

• Material
  • objektglas med mattfält
  • pipettspetsar 10 - 50 µL
  • glaskyvetter med lock
  • täckglas No 0.

• Reagenser
  • Formaldehydlösning 3,7 % (=10 % formalin. En del koncentrerad formaldehyd (37 - 40 %) späds med 9 delar destillerat vatten.
  • Metanol 99 %
  • Förstärkt trikromfärg (Trichrome Blue, Meridian 400501)

Ovanstående färgreagens består av följande ingredienser:

• Chromotrope 2R 60,0 g
• Aniline Blue 5,0 g
  • Fosforwolframsyra 2,5 g
  • Isättika 30 mL
  • Destillerat vatten 1000 mL

• • Ättiksyra i etanol 90 %
  • Ättiksyra (isättika) 100 % 4,5 mL
  • Etanol 90 % 995,5 mL
  • Etanol 95%,
  • Etanol 99, 5 %
  • Histoclear

Apelsinolja, d-limonen, C10H16 70-100 % National Diagnostics HS-200

• DPX mounting medium BDH 36029 4H
• Immersionsolja

Analysprocedur

Förbehandling av provmaterial

Feces: okoncentrerad feces fixeras i formaldehyd eller SAF.

Lämplig spädning: 1 del feces till 3 delar fixativ. Mycket tunn fecesblandning centrifugeras och sedimentet används för utstryk. För att höja känsligheten färgas även ett koncentrerat fecesprov – späd sedimentet till lämplig tjocklek.

• Färgningsprocedur
  • 1. Märk önskat antal objektglas. Glöm ej att ta med positiv kontroll.
  • 2. Stryk med pipettspetsen ut ca 10 µL av provmaterialet. Gör mycket tunna utstryk.
  • 3. Låt preparatet lufttorka.
  • 4. Fixera glaset 5 min i metanol.
  • 5. Placera glaset i trikromfärg. Låt stå 90 min i rumstemperatur.
  • 6. Torka av färgöverskottet på glasets baksida mot en allduk. Tryck försiktigt glasets framsida mot allduken.
  • 7. Avfärga i avfärgningslösning (ättikssyra i 90 % etanol) ungefär 5 sek. Låt överskott av vätska rinna av mot allduk mellan varje kyvett.
  • 8. Skölj hastigt i 95 % etanol.
  • 9. Låt stå i 95 % etanol 5 min.
  • 10. Låt stå i 99,5 % etanol 10 min.
  • 11. Låt stå i Histoclear 10 min.
  • 12. Montera det våta glaset med DPX och täckglas. Låt torka. Förvara glasen skyddade mot ljus.

Granskning av preparat

Granska 200 synfält med 100x immersionsobjektiv. För morfologiska kriterier hänvisas till avsnittet om microsporidia i denna bok.

Kvalitetssäkring

Positiv kontroll som innehåller formaldehydfixerade microsporidiasporer. Förvaras i kylskåp och behandlas som övriga prov. Lämpligt bildmaterial finns under referens 3 och 4.

Referenser

• 1. Ryan NJ, Sutherland G, Coughlan K, Globan M, Doultree, Marshall J, Baird, Pedersen J, Dwyer B. A new trichromeblue stain for detection of microsporidial species in urine, stool, and nasopharyngeal specimens. 1993;31:3264-3269.
• 2. Meridian Diagnostics, Inc. Para-PacTrichrome Blue. Produktinformation.
• 3. Ash L, Orihel C. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago, fourth edition, 1997.
• 4. Rondamelli EG, Scaglia M. Atlas of human protozoa. Masson 1993.