Bilagor till VRE-diagnostiken

Artikel publicerad februari 2012. Texten är preliminär ännu ej godkänd genom konsensusförfarande

---

Till huvudartikeln Vankomycinresistenta enterokocker (VRE), referensmetodik

---

Bilagor till VRE-diagnostiken

Bilaga 1

Diagnostiska minimikriterier
 för artdiagnostik 
av enterokocker (referensmetodik)

• Enterococcus spp: Minimikriterier:
 Typisk kolonimorfologi (gråvita kolonier på blodagar, kan ha ingen hemolys, alfa- eller betahemolys, oftast gula kolonier på CLED-agar), katalasnegativa grampositiva kocker i par eller korta kedjor, PYR- och eskulin-positiva. Ytterligare egenskaper för enterokocker är förmåga att växa i buljong med 6,5 % NaCl, positiv i agglutinationstest för Lancefields grupp D.

För diffentiering av enterokocker se
(Tabell 4)

Bilaga 2


Anrikningsmedium för VRE-screening

• Galla-eskulinbuljong (Referenssubstrat):
  • Typexempel Bile Esculin Azide Broth (Biolife) 42.7 g/L
  • Innehåll------ Gram/L
  • Trypton -------17
  • Pepton --------3
  • Jästextrakt------ 5
  • Oxgalla-------- 10
  • Natriumklorid------ 5
  • Natriumcitrat------ 1
  • Eskulin---------- 1
  • Fe-ammonium-citrat------ 0,5
  • Natriumazid-------0,25

• pH 7.1± 0.2

Galla-eskulinbuljong tillreds enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt vankomycin 4 mg/L och aztreonam 60 mg/L.

• Alternativ anrikningsbuljong (Todd-Hewittbuljong)
  • Typexempel:T-H-buljong (BD)
  • Innehåll --------Gram/L
  • Infusion av kött------ 3,1
  • Neopepton------20,0
  • Dextros------ 2,0
  • Natriumklorid------ 2,0
  • Dinatriumfosfat------ 0,4
  • Natriumkarbonat------ 2,5

• pH 7,8± 0.2

Todd-Hewittbuljong tillreds enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt vankomycin 4 mg/L och aztreonam 60 mg/L.

Bilaga 3

PCR-metod för påvisande av van-gener


vanA och vanB PCR för LightCycler (FRET-hybridiseringsprobe)

Reaktionsvolymen är 20 μL varav 5 μl är templat. PCR mixen innehåller 1xHYB- master (Roche Diagnostics), 2 mM MgCl2, 1 μM av varje primer och 0.2 μM av varje hybridiserings-probe.

• Temperaturprofil LightCycler
  • 
Enzymaktivering: 95 °C 10 min. Slope 20 °C/s. 1 cykel.

  • Amplifiering: 95 °C 15 sek, 50 °C 15 sek, 72 °C 25 sek. 40 cykler. Slope 20 °C/s.
  • Kylning: 40 °C 60 sek. Slope 20 °C/s.


Avläsning med color compensation. VanA och vanB avläses i olika kanaler.

Smältpunktanalys behövs inte.

---

VanA och vanB PCR för Rotor-Gene (TaqMan probe)

Reaktionsvolymen är 20 μL varav 2 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x perfeCta qPCR FastMix (Quanta bioscience), 0,2 μM av varje primer, 0,075 μM av varje Taqman-probe.

• Temperaturprofil för Rotor-Gene

  • Enzymaktivering: 95 °C i 3 min
  • 
Amplifiering: 95 °C i 3 sek, 60 °C i 20 sek. 40 cykler.


VanA och vanB avläses i olika kanaler. Smältpunktanalys behövs inte.

---

PCR-metod för molekylärbiologisk verifiering av E. faecalis och E. faecium

DdlE-PCR för LightCycler: Reaktionsvolymen är 20 μL varav 4 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x LC- master, 4 mM MgCl2, 0,5 μM av varje primer och 0,04 units/μL FastStart Taq DNA-polymeras.

LC-master innehåller 2x FastStart PCR-buffert (Roche diagnostics), 4 % DMSO (Sigma), 0,4 mM dNTP (Roche diagnostics), 0,2 mg/mL BSA (Roche diagnostics) och 1,2x SybrGreen I (Molecular Probes).

• Temperaturprofil LightCycler
  • 
Enzymaktivering: 95 °C 10 min. Slope 20 °C/s. 1 cykel.
  • 
Amplifiering: 95 °C 15 sek, 54 °C 10 sek, 72 °C 25 sek. 35 cykler. Slope 20 °C/s.
  • Smältpunktsanalys: 60–90 °C. Slope 0,1 °C/s

  • Kylning: 40 °C 30 sek. Slope 20 °C/s.

Avläsning: Metoden är en cybergreenmetod och läses av i våglängd 530 nm. Positiva prov ska uppvisa en amplifieringskurva samt att produkten ska ha en smälttopp runt 84–85 °C.