Syfilis-bilaga 5
Huvudartikel: Syfilis
Sekundärartikel till: Syfilis-laboratoridiagnostik
Metoder för diagnostik av Treponema pallidum
5.1. Metodbeskrivning för PCR-detektion av Treponema pallidum (ej referensmetod)
5.1.1. Provtagningsmaterial och provtagning
Pinnprov från sårkant (pinnskaftet ska ej vara av trä) för transport i koksalt, PBS eller transportmedel avsett för odling. Lämplig pinne är Copan 155C (pinne av plast med rayontip). Prov från andra provtagningslokaler transporteras som för odling. Lämpligt transportmedium är Copan 114C.USE (kolat medium, provtagningspinne som ovan).
Prov förvaras i kyl fram till omhändertagandet.
5.1.2. Provhantering på laboratoriet
Sår: Överför provtagningspinne till centrifugrör med 200 mL PBS/koksalt alternativt 1 mL av provet om detta transporterats i PBS/koksalt. Centrifugera 12 000 × g 10 min. Häll av supernatanten.
Nukleinsyra extraheras från provet med valfri metod. På bakteriologiska laboratoriet i Göteborg används Roche Amplicor, sputum sample preparation kit enligt leverantörens instruktioner.
- Likvor: 1 mL likvor centrifugeras 12 000 × g 10 min i 1,5 ml centrifugrör. Fortsätt enligt ovan provmaterial från sår.
Nukleinsyraamplifiering med PCR Primrar för detektion av bmp-genen kodande för 47-kDa membran immunogen (basic membrane protein)
- KO3A Forward 5’ GAAGTTTGTCCCAGTTGCGGTT3’
- KO4 Reverse 5’ CAGAGCCATCAGCCCTTTTCA3’
Amplifiering med ovanstående primerpar ger ett DNA-fragment av storleken 239 bp.
Mix / PCR-rör
5.2. Serologisk diagnostik av syfilis (referensmetoder)
Allmänt
Infektioner med T. pallidum ger upphov till ett flertal antikroppar och dessa indelas i två grupper:
- 1). Ospecifika antikroppar riktade mot lipoidalt antigen i T. pallidums cellvägg och sådant lipoidalt antigen som uppstår genom vävnadsskada vid interaktion mellan värd och mikroorganism men även vid andra sjukdomstillstånd.
- 2). Specifika antitreponemala antikroppar riktade mot T. pallidum och som bestäms genom att man använder hela bakterier eller preparation av dessa som antigen. Sådana antikroppar är av två typer, nämligen gruppspecifika antikroppar även mot icke patogena spiroketer och antikroppar specifika för T. pallidum.
Humorala antikroppar mot T. pallidum saknar sannolikt helt skyddseffekt mot förnyad infektion. Förekomst av specifika IgM-antikroppar talar för aktiv infektion. Dessa antikroppar kan dock vara svåra att påvisa vid sena infektioner med höga IgG-nivåer.
A. Ospecifika test
- Flockningsreaktioner/reagintester som
- Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) test eller
- Rapid plasma reagin (RPR) test
- Komplementbindningsreaktion
- Wasserman-reaktion (WR)
B. Specifika antitreponemala test
- Treponema passiv particle-agglutination (TPPA)
- IgM-ELISA
- Analysinstrument, exempelvis Abbotts Architect
5.2.1. VDRL/RPR
Analysprincip/Teststrategi
Vid reaktionen mellan ospecifika serumantikroppar (reaginer) och kardiolipin – lecitin – kolesterolantigen (VDRL-antigen) bildas aggregat. Denna aggregatbildning kan avläsas direkt i mikroskop (VDRL-test), eller okulärt vilket underlättas av tillsatta mikropartiklar av kol i antigenberedningen (RPR-test). Testerna är lätta att standardisera och har i stort sett samma prestanda. Vid VDRL-testen sätts antigenet till inaktiverat serum (observera att likvor inte skall vara inaktiverat), varefter eventuell aggregation av partiklar avläses i mikroskop. För RPR-testet används icke inaktiverat serum. Testerna kan med fördel utföras kvantitativt genom att antigenet sätts till olika spädningar av serum eller likvor. I svaret anges högsta spädning som ger positiv reaktion. Det bör noteras att om man endast använder VDRL-antigen i en låg serumspädning finns risk för prozonfenomen, det vill säga falskt negativt resultat vid mycket höga antikroppsnivåer.
VDRL/RPR används dels vid primär screening av blodgivare och gravida och dessutom vid utredning av misstänkt syfilis inklusive neurosyfilis. Många svenska laboratorier har övergått till att primärt använda specifika tester (se Abbotts Architect Syphilis TP-test, denna bilaga). Ospecifika tester kan ibland bli snabbare positiva vid tidig syfilis och har därför ännu en plats som komplement vid primärdiagnostiken. TPPA har dock till skillnad från den tidigare rekommenderade TPI lika hög sensitivitet som VDRL vid primär lues. Vid misstanke om neurosyfilis skall VDRL/RPR användas för primär undersökning av likvor.
Titrering av serum för kvantitativ analys med ospecifik test är användbart för att följa behandlingsresultatet. Efter avslutad behandling för primär eller sekundär syfilis utförs testning efter tre, sex och tolv månader. Vid kvarstående titer genomförs ytterligare test efter 24 månader. Observera att de ospecifika reaginerna i normalfallet inte längre kan påvisas efter cirka 1-2 år efter genomförd behandling. Livslångt kvarstående titrar kan dock förekomma, framförallt vid sent insatt behandling. Efter behandling av neurolues bör undersökning av likvor göras efter sex månader. Reagintesterna kan då ha blivit negativa.
Referenssera/Kontrollsera
Primär kalibrator är densamma för alla serologiska syfilistester (1:st international WHO standard human syphilis). Testerna kalibreras 2 gånger årligen med detta serum. Positiv kontroll tillverkas på det enskilda laboratoriet och används vid varje testomgång.
Analysproceduren
Nedan beskrivs kortfattat den vanligt förekommande kommersiella RPR-testen ”Murex VDRL-antigen med kolpartiklar”. Produkten är CE-märkt enligt IVD-direktivet.
Testen utförs på objektglas eller ljus analysbricka med ringar, cirka 18 mm i diameter.
- Blanda 16 µL VDRL antigensuspension med 50 µL prov på glaset eller analysbrickan.
- Skaka glaset eller analysbrickan 8 minuter på en skakapparat med horisontell plattform som roterar 100 varv/min med en rotationsdiameter på 18-22 mm.
- Avläs resultatet visuellt i god belysning. Ett positivt resultat indikeras genom att klart synliga svarta aggregat av partiklar utvecklas.
Titrering av prover görs i serien 1, 1/2 -1/128. Det är lämpligt att utföra titrering upp till 1/16 redan primärt för att undvika eventuellt prozonfenomen. Titer rapporteras till klinik.
Tolkning och prestanda
Ett positivt resultat indikerar förekomst av reagin, men är inte liktydigt med diagnosen syfilis. I litteraturen anges sensitiviteten för dessa tester till 74-100 % för primär syfilis, närmare 100 % vid sekundär eller latent syfilis, men bara 37-94 % vid sen syfilis. Specificiteten är cirka 93-99 %. Vid neurosyfilis är känsligheten maximalt cirka 70 %, men positiv test på likvor anses liktydlig med neurosyfilis. Det skall observeras att påvisbara reaginer uppstår först efter cirka 4-6 veckor efter infektionstillfället. VDRL är ospecifikt positivt i cirka 1 % av blodgivarsera. Observera att VDRL-titrering ger lägre titrar och sämre reproducerbarhet än WR och TPPA.
Både falskt negativa och biologiskt falskt positiva (BFP) resultat ur ett diagnostiskt perspektiv kan erhållas med flockningstester. Upprepade positiva testresultat tillsammans med negativa specifika antitreponemala tester orsakas ofta av herpes genitalis. Som orsak till övergående BFP har också angivits graviditet, narkotikamissbruk, mykoplasmapneumoni, tuberkulos och malaria. Vid bestående (längre än 6 månader) BFP kan orsakerna vara autoimmun sjukdom som SLE, reumatoid artrit, autoimmun struma, poyarteritis nodosa, levercirros, malignitet, narkotikamissbruk och lepra. I över hälften av bestående BFP finner man emellertid ingen orsak. Detta är vanligare hos äldre och kan vara familjärt betingat. Vid BFP är det ofta inkongruens mellan VDRL/RPR och WR-testerna.
Svarsrutiner
VDRL/RPR-resultatet anges som positivt/negativt med angivande av eventuell titer.
REFERENSER
- 1. Hook EW, Marra CM. Acquired syphilis in adults. N Engl J Med. 1992; 326: 1060-1065
5.2.2. Wassermanreaktion (WR)
Analysprincip/Teststrategi
I ett första steg binds i provet förekommande reaginer till kardiolipinantigen (VDRL-antigen) varvid ett antigen/antikroppskomplex bildas. Samtidigt tillsätts ett hemolytiskt system bestående av sensibiliserade fårblodkroppar, amboceptor (antikroppar mot fårblodkroppar) och marsvinskomplement. Eftersom komplementet binds till antigen/antikroppskomplexet hemolyseras inte blodkropparna av amboceptorn, utan dessa sjunker till botten. Om provet saknar reaginer är komplementet fritt och bidrar till lys av blodkropparna. I svaret anges den högsta serumspädning som ger 50 % hemolys eller mindre.
Analysen rekommenderas som kompletterande ospecifikt test vid utredning av misstänkt syfilis, i första hand vid sannolika biologiskt falskt positiva (BFP) VDRL/RPR-resultat. På grund av sin något högre kvantitering och reproducerbarhet kan WR vara att föredra framför flockningstesterna vid uppföljning av behandlingsresultat. Testerna är för övrigt prestandamässigt i stort sett likvärdiga, men WR är något mer arbetsintensiv.
Referenssera/Kontrollsera
Primär kalibrator är densamma för alla serologiska syfilistester (1:st international WHO standard human syphilis). Testerna kalibreras 2 gånger årligen med detta serum. Positiv och negativ kontroll tillverkas på det enskilda laboratoriet och används vid varje testomgång. Positiv tillverkas från positiva patientprover och spädes till lämplig titernivå med primär kalibrator som jämförelse. Titreringen skall utföras vid tre separata tillfällen.
Analysproceduren
- I ett första steg utförs amboceptortitrering i provrör (görs vid batchbyte). Därvid tillsätts komplement i överskott och amboceptor i den minsta mängd som ger fullständig hemolys. Man söker den spädning som innehåller 6 enheter/0,025 mL buffert.
- I ett andra steg utförs på motsvarande sätt komplementtitrering, varvid man använder titrerad amboceptor. Man söker den komplementspädning som innehåller 1,5 enheter/0,025 mL, varvid 1 enhet är den minsta mängd komplement som ger fullständig hemolys.
- Testet utförs enligt medföljande anvisningar. I princip blandas patientserum i olika spädningssteg med antigensuspension, 2 % fårblod, och uttitrerad amboceptor och komplement i mikrotiterplattor. Brunnar utan antigensuspension bereds också för varje prov för att möjliggöra bedömning av eventuell antikomplementär aktivitet hos proven. Plattorna inkuberas i 37 ºC i en timme, varefter de sätts i kylskåp för att tillåta att kvarvarande blodkroppar kan sjunka till botten.
- Resultatet avläses varvid bedömning görs av hemolys som protokollförs som - eller + (positivt resultat) och ++ eller +++ (negativt resultat).
Tolkning och prestanda
Ett prov med <50 % hemolys i godkänd omgång betraktas som positivt och uttitreras om så inte skett från början. Om provet är starkt antikomplementärt (både prov och serumkontroll ger <50 % hemolys) titreras detta vidare med och utan antigen för att bedöma graden av antikomplementär aktivitet i provet. Allmänna prestanda är i princip desamma som för VDRL/RPR.
Kvalitetssäkring
Två egentillverkade kontroller (positiv och negativ) medtages vid varje analystillfälle. Dessa skall vara kalibrerade mot primär kalibrator och får avvika högst ett spädningssteg för godkänd analysomgång.
Svarsrutiner
WR svaras ut som positiv med angivande av titer (den högsta spädning som ger <50 % hemolys) eller negativ (>50 % hemolys).
REFERENSER
- 1. Wassermann, A., Neisser, A. and Bruck, C. Eine serodiagnostische Reaktion bei Syphilis. Dtsch. med. Wschr. 1906; 32:745.
5.2.3 TPPA
Analysprincip/Teststrategi
För analysen används speciella bärarpartiklar av gelatin som har sensibiliserats med renade patogena T. pallidum (Nichols stam). Principen för testen är att dessa partiklar agglutinerar i närvaro av specifika antitreponemala antikroppar i humant serum eller human plasma.
I föregående upplaga av denna bok angavs för verifiering T. pallidum hemagglutinationstest (TPHA) som referensmetod. TPPA är snabbare och enklare att utföra samt avläsa men har för övrigt samma prestanda och ersätter därför TPHA som referensmetod. FTA-abs rekommenderas inte längre, och TPI är inte längre tillgänglig.
Referenssera/Kontrollsera
Primär kalibrator är densamma för alla serologiska syfilistester (1:st international WHO standard human syphilis). Testerna kalibreras 2 gånger årligen med detta serum. Positiv kontroll tillverkas på det enskilda laboratoriet och används vid varje testomgång.
Analysproceduren
Nedan beskrivs kortfattat en kommersiell TPPA, Serodia –TP.PA (Fujirebio inc). Produkten är CE-märkt enligt DVD-direktivet.
- I förpackningen ingår frystorkade sensibiliserade och icke-sensibiliserade gelatinpartiklar som rekonstitueras med särskild medföljande lösning och 100 μL av respektive lösningar sätts till första brunnarna i mikrotiterplattor. Till följande brunnar sätts 25 μL av lösningarna.
- Icke inaktiverat serum eller plasma och positiv kontroll liksom laboratoriets egentillverkade positiva kontroll sätts till första brunnen och titreras därefter i de följande brunnarna enligt medföljande anvisningar. Mixa.
- Inkubera utan agitation i rumstemperatur mellan 2 timmar och ett dygn. Avläs därefter.
- Plattorna avläses okulärt. Ett negativt resultat karakteriseras av att partiklarna sedimenterat ner till botten av brunnen och där centralt format en distinkt pellet. Ett positivt resultat karakteriseras av att agglutinerade partiklar sedimenterat till ett jämnt skikt i botten på brunnen. Svagt positiva reaktioner förekommer som mellanformer (kompakt ring av partiklar eller stor ring med oskarpa kanter).
Tolkning och prestanda
För godkänd analysomgång skall reaktionerna med osensibiliserade gelatinpartiklar uniformt utfalla negativt och positiv kitkontroll skall ha en titer på 1/320. Egen positiv kontroll skall uppfylla uppsatta kriterier. Omtestning bör ske om även osensibiliserade partiklar orsakat agglutination. Därvid absorberas först provet mot rekonstituerade osensibiliserade partiklar enligt medföljande anvisningar.
Analysen har hög sensitivitet, dvs. motsvarande 70-90 % vid primär syfilis, i senare stadier av sjukdomen är sensitiviteten nära 100 %. Specificiteten är också hög och överstiger 95 %. De specifika antikropparna utvecklas något senare i sjukdomsförloppet än de ospecifika reaginerna (se ovan) och börjar uppträda mellan 5-12 veckor efter infektionstillfället. Däremot kvarstår antikroppsnivåerna livslångt, varför specifika tester inte kan användas för bedömning av behandlingseffekt.
Svarsrutiner
Resultatet av godkänd testning rapporteras som TPPA negativ eller positiv med angivande av titer.
5.2.4. Specifik syfilisserologi utförd med ELISA-teknik
Analysprincip/Teststrategi: Flera specifika EIA-tester baserade på T. pallidum-sonikat eller rekombinanta antigen har utvecklats för syfilisdiagnostik. Kommersiella sådana har i olika publikationer visats ha samma sensitivitet och specificitet som övriga specifika syfilistester. Captia Syphilis-M test påvisar IgM-antikroppar och rekommenderas bland annat för att påvisa kongenital syfilis. Western blot baserade EIA-tester är också under utveckling. Western blot tester som detekterar IgM antikroppar mot T. pallidum har i vissa studier till och med uppvisat högre sensitivitet och specificitet än ELISA vid diagnostik av kongenital syfilis.
IgM-ELISA rekommenderas i dag som verifierande specifik test tillsammans med TPPA när ospecifika tester utfallit positivt. Specifika IgM-antikroppar uppträder visserligen något senare än de ospecifika reaginerna, men blir ofta positiv innan andra specifika tester blir det. Därmed kan testen användas för att påvisa primär syfilis, tidigt i förloppet. Vissa studier talar för att IgM-antikroppar även uppträder vid reinfektion. IgM-ELISA är också användbar för att påvisa anti-TP-antikroppar vid misstänkt kongenital syfilis. Sådana antikroppar kan inte överföras från mor till barn, varför förekomst av sådana i blodprov från barnet indikerar kongenital syfilis.
Referenssera/Kontrollsera
Primär kalibrator är densamma som för övriga diagnostiska syfilis-tester (se ovan).
Analysproceduren
Utförs enligt tillverkarens anvisningar.
Tolkning och prestanda
Reaktiviteten för IgM-testerna motsvarar i huvudsak TTPA, utom vid reinfektioner då känsligheten är lägre. Risk för falskt positiva resultat föreligger om serum innehåller reumafaktor.
Svarsrutiner
Resultaten av tekniskt godkänd testning rapporteras som fynd av specifika IgM-antikroppar påvisade/ej påvisade.
REFERENSER
- 1. Lefevre, J.C., Bertrand, M.A., och Bauriand, R. Evaluation of the Captia Enzyme immunoassays for detection of immunoglobulins G and M to T. pallidum in syphilis. J. Clin. Microbiol. 1990; 28(8):1704-1707.
5.2.5. Specifik syfilisserologi utförd på kommersiella analysinstrument
Analysprincip/Teststrategi
Specifika antikroppar mot T. pallidum kan påvisas med olika tekniker och ett flertal kommersiella applikationer finns att tillgå. Förutom TPPA och olika ELISA-baserade metoder för påvisande av i huvudsak IgM är användandet av olika fabrikat av automatiserade analysutrustningar spridd vid landets mikrobiologiska laboratorier. Exempel på sådan utrustning är Architect (Abbott) och Liaisonâ (DiaSorin), avsedda för screening av stora provmängder, exempelvis från blodgivare, plasmagivare eller gravida. Testerna påvisar specifika anti-T. pallidum-antikroppar med varianter av kemilumiscensmetoder och har i jämförande studier befunnits likvärdiga med sensitivitet och specificitet på >99 % jämfört med EIA-tester och TPPA (1). Dessa och likvärdiga metoder kan därför anses utgöra standard för screening av blodgivare, plasmagivare, gravida och vara ett alternativ till VDRL/RPR vid utredning av misstänkt syfilis.
Referenssera/Kontrollsera
Primär kalibrator är densamma som för övriga diagnostiska syfilis-tester (se ovan).
Analysproceduren
Här beskrivs som exempel kortfattat provhanteringen i Architect. Analysen (Chemiluminescent Microparticle Immunoassay, förkortas CMIA) utförs automatiskt i två steg. Den använder rekombinanta specifika antigen med den ungefärliga storleken 15, 17 och 47 kDalton klädda till mikropartiklar. Fabrikanten tillhandahåller med varje kit en kalibrator som skall användas i tre replikat vid kalibrering av metoden. Kalibreringen kontrolleras mot medföljande kitkontroller.
- Patientserum sätts till antigenklädda mikropartiklar suspenderade i buffert varvid eventuella anti-TP-antikroppar i provet binder till partiklarna. Akridinmärkt anti-humant IgG – och IgM-konjugat tillsätts och därefter två olika triggerlösningar.
- Den följande kemilumiscerande reaktionen mäts i relativa ljusenheter (RLU). Det råder en direkt relation mellan mängden antikroppar i provet och uppmätta RLU.
- Fabrikantens kit-kontroller och laboratoriets egentillverkade positiva kontroller används vid varje analystillfälle. Cut-off-värde bestäms som 0,2×erhållet värde för kalibratorn.
- Prover med S/CO-värden <1,0 betraktas som icke-reaktiva (negativa). Prover med S/CO-värden på >1,0 betraktas som reaktiva (positiva).
Tolkning och prestanda
Analysens precision anges till <15 % av den medföljande positiva kontrollen. Initialt reaktiva prov centrifugeras för omtestning ×2. Om omtestningen blir negativ båda gånger betraktas provet som icke-reaktivt (negativt).
Svarsrutiner
Icke-reaktiva prover svaras ut som negativa. Svaret kan vid klinisk frågeställning kompletteras med önskan om nytt senare taget prov för påvisande av möjlig serokonversion (se under TPPA om tidpunkt för uppträdandet av specifika antikroppar).
Reaktiva prover svaras ut som positiva och kompletteras med TPPA och IgM-ELISA och eventuellt med VDRL/RPR/WR-titer.
REFERENSER
1. Yoshioka N, Deguchi M et al. Evaluation of a chemiluminescent microparticle immunoassay for determination of Treponema pallidum antibodies. Clin Lab. 2007;53(9-12):597-603.