Shigella

Huvudartikel

---

Till innehållsförteckngen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

Se även

Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar med falldefinition i artikeln Shigellainfektion

---

Shigella

Smittämnet

Shigella är en gramnegativ stav som tillhör familjen Enterobacteriaceae. Shigella har, baserat på en kombination av biokemisk profil och specifik agglutination, indelats i fyra olika species, Shigella dysenteriae typ 1-13, Sh. flexneri typ 1-6, Sh. boydii typ 1-18 och Sh. sonnei. Gemensam virulensfaktor för alla Shigella är en stor plasmid som bl.a. kodar för invasivitetsproteiner. Hos Sh. sonnei sitter även generna för O-antigenet på denna plasmid.

Shigella och Escherichia coli kan med DNA/DNA homologistudier inte skiljas från varandra (Rowe & Gross, 1984). De är alltså snarlika eller kan till och med i strikt bemärkelse sägas tillhöra samma art. Det finns mellan Shigella och E. coli en ”gråzon” där man finner bakterier med samma virulensplasmid och biokemi som hos Shigella, men som inte agglutinerar i Shigellaantiserum. Bland dessa bakterier finns sådana som av ett internationellt referenslaboratorium (Colindale) benämns provisional (= provisorisk Shigella) och som i framtiden kan komma att klassificeras som nya serotyper av Shigella. Genus Shigella utökades t.ex. år 1985 och 1990 med tillsammans sex nya serotyper (Wathen-Grady et al 1985; Wathen-Grady et al 1990). Andra bakterier i gråzonen kan på grundval av biokemiska reaktioner (främst Christensens citrat) uteslutas från genus Shigella och betecknas följaktligen enteroinvasiva E. coli (EIEC).

Efter vad man känner till idag skiljer sig inte symtombild vid infektioner med dessa bakterier i ”gråzonen” från mildare former av klassisk shigellos.

Patogenes och patofysiologi

Infektionsdosen för Shigella kan vara mycket liten, ca 101-102 bakterier. Viru-lensen hänger samman med förekomsten av invasivitetsgener som reglerar bild-ning av medverkande polypeptider. Bakterierna invaderar tjocktarmsmukosans epitelceller där de multipliceras. Detta leder ofta till abscessbildning och nekroser i tarmslemhinnan, blödningar och bildning av pseudomembraner. Under utläkningen kan granulationer utvecklas. Bakterierna invaderar sällan urin¬vä-garna eller blodbanan.

Shigella dysenteriae typ 1 är den enda varianten som bildar ett potent exotoxin, Shigatoxin (stx1), vilket bidrar till virulensen och är identiskt med ett toxin som bildas av Entero Hemorragisk ''E. coli'' (EHEC).

Symtom och klinisk bild

Efter en kort inkubationsperiod (1-2 dygn) debuterar Shigella-infektionen med buksmärtor, feber och frekventa vattniga diarréer, som i många fall utvecklas till klassisk bacillär dysenteri med pus, blod och slem i avföringen. Sjukdomen är hos immunkompetenta personer som regel självbegränsande inom några få da¬gar. Mycket svåra sjukdomstillstånd ses framför allt med Shigella dysenteriae. Efter Shigella flexneri infektion ses ibland reaktiva artriter. Kroniskt bärarskap är mycket ovanligt efter behandling men recidiverande infektioner kan förekomma.

Laboratoriediagnostik

Allmänt

Liksom för Salmonella finns brister i den bakteriologiska odlingsdiagnostiken. Detektionsgränsen är högre dels p.g.a. Shigella-bakterierna växer sämre på använda substrat dels därför att anrikning inte används rutinmässigt då bra anrikningssubstrat saknas. Risken för felaktiga svar är dessutom större då Shigella egentligen är en variant av E. coli. I avsaknad av tydlig standard varierar följdriktigt prestanda väsentligt mellan olika laboratorier.

Säkerhetsaspekter

Infektionsdosen för Shigella är mycket liten. Vid allt arbete med levande Shigella-bakterier eller misstänkt Shigella är det viktigt att adekvat skyddsutrustning används. Att notera är att Sh. dysenteriae typ 1 sedan 1998 (AFS 1997:12) är placerad i skyddsklass 3(**) och att det krävs tillstånd av AV för att få arbeta med denna bakterie.

Referensmetodik

Referenssubstrat

Nedanstående substrat utgör referenssubstrat för isolering av Shigella-bakterier från humana fecesprov (recepten återfinns i bilaga 1.1).

Generellt rekommenderas något av de kommersiella halvfabrikat som finns på marknaden. Angående testning av loter och fortlöpande kvalitetskontroll, se bilaga 1.2 - substratkontroll.

XLD-agar [[[Bilaga 1]].1.1]: Shigella-bakterier växer inom ett dygn med semiopaka, släta och blanka färglösa 0,5-2 mm stora kolonier (framstår röda mot me¬diets grundfärg). Särskilt Shigella sonnei kan uppvisa fasva¬riation inom och mellan kolonier. Råa kolonier med ojämna kanter kan därvid förekomma.

Shigella species växer i allmänhet med lägre GI än Salmonella, vissa stammar växer inte alls.

DC-agar modifierad enligt Hynes [Bilaga 1.1.2]: Shigella-bakterier växer inom två dygn (ca 1/3 av stammar har inte växt ut efter ett dygn) med relativt låga GI-värden, ofta mindre än 50 %. Upp till 20 % av stammar som växer på icke inhi¬bitoriskt substrat eller på XLD uppvisar mycket dålig eller ingen växt.

MacConkey-agar [[[Bilaga 1]].1.15]: Shigella-bakterier växer inom ett dygn (GI överstigande 50 %) med konvexa, semi¬opaka, råa och färglösa kolonier. Inkuberas i 35 °C – 37 °C i ett dygn.

Ett bra anrikningssubstrat saknas för Shigella men Selenit-buljong kan anrika särskilt Sh. sonnei [Bilaga 1.1.4].

Isolering

Primär utodling: Provmaterial på provtagningspinnen stryks ut på XLD-agar och DC-agar och sekundärstryk görs. Plattorna inkuberas i 35 °C - 37 °C. XLD-plattan avläses efter ett dygn samt DC-plattan efter ett och två dygn.

Anrikning och sekundär utodling: Anrikning av Sh. sonnei kan förekomma när Selenit-buljong används. (Anrikningsförfarandet ingår dock inte i referensförfarandet för Shigella-diagnostiken.) Provtagningspinnen stoppas efter den primära och sekundära utstrykningen ned i buljongen och inkuberas över natt i 35 °C - 37 °C. Med plastinös görs där¬efter utstryk på XLD-agar. Plattorna inkuberas vid 35 °C - 37 °C över natt och avläses.

Identifiering och minimikriterier

Presumtiv diagnos: På XLD-agar växer Shigella-bakterier inom ett dygn med semiopaka, släta och blanka färglösa 0,2-2 mm stora kolonier. Särskilt Shigella sonnei kan uppvisa fasvariation, varvid råa kolonier med ojämna kanter kan förekomma.

På DC-agar enligt Hynes växer Shigella inom två dygn (ca 1/3 av stammarna har inte växt ut efter 1 dygn) med semiopaka, släta eller råa, färglösa (ibland rosa/röda opaka, Shigella dysenteriae typ 1 kan vara rödlila). Centralt upphöjda (”stekt ägg”) kolonier förekommer.

Misstänkta kolonier plockas, rensprids på MacConkey-agar och identifieras med testbatteri enligt Tabell 10 efter växt över natten i 35 C– 37 C.

Observera att det är olämpligt att använda ett mer selektivt substrat då växt av eventuella förorenande koliforma bakterier då kan undertryckas. Testbatteriet inkuberas över natten i 35 °C - 37 °C. Resultatet avläses och tolkas enligt tabell 10.

Tabell 10. Biokemiska referenssubstrat och förväntade resultat efter inkubering i 35-37 C vid identifie¬ring av Shigella-bakterier. ¬_____________________________________________________________

Mannit1) LD2) OD3) H2S2) ONPG Indol4) Urea2)

Sh. sonnei +/0 gas - + - + - - Sh. boydii +/0 gas - - - + - - Sh. boydii/flexneri +/0 gas - - - - + -

         ”  	+/0 gas         -          -   	  - 	     -   	   -              -                        

Sh. dysenteriae - - - - + - -

        ”   	     - 		   -          - 	  -   	      -  	  +              -                       
        ”  	     -    	   - 	    - 	  -	      -    	   -  		    -

_____________________________________________________________ 1) Mannit utan gas i Durhamrör. Enstaka stammar av Sh. boydii och Sh. flexneri kan jäsa mannit under gasutveckling. Enstaka stammar av Sh. flexneri, Sh. boydii och Sh. sonnei är negativa i mannit. 2) Positiv reaktion i endera LD, H2S, urea eller oxidas utesluter genus Shigella. 3) Enstaka isolat av Sh. boydii och Sh. flexneri kan vara OD-positiva. Enstaka isolat av Sh. sonnei kan vara OD-negativa. 4) Positiv reaktion i både ONPG och indol utesluter i praktiken genus Shigella. Enstaka isolat av Sh. sonnei kan vara ONPG-negativa.

Bakterier som på omstrykningen har en för Shigella typisk kolonimorfologi och som jäser enligt något av utfallen i tabell 10 misstänks vara Shigella. Jäsning av glukos är ett minimikriterium för presumtiv identifiering av Shigella. Jäsning av glukos kan normalt avläsas i LD-röret genom färgomslag till gult.

Ett isolat som avviker i mer än en reaktion (enligt fotnot 1-4 tabell 10) kan i praktiken uteslutas från genus Shigella.

Isolat som misstänks vara Shigella karakteriseras ytterligare med ett kommersiellt testsystem (t.ex. API 20E). Kvarstår därefter misstanke om Shigella, sänds isolatet till SMI för identifiering och typning.

Slutlig diagnos: För identifiering av Shigella krävs förutom testerna i den pri-mära identifieringen att stammen är negativ i rörlighet och VP. Vidare krävs att bakterier avdödade genom kokning i 2 timmar agglutinerar i monospecifikt antiserum. Anledningen till att agglutinationen skall göras på kokta bakterier är förekomst av ett antal korsreaktioner, med främst E. coli där olika proteinantigener är ansvariga. Dessa förstörs genom kokning.

Vid ett konsensusmöte om fecesdiagnostik i april år 2002 beslutades att alla invasiva bakterier i gråzoonen mellan Shigella och EIEC, d.v.s jäser som Shigella, har virulensplasmiden men som inte agglutinerar i specifikt antiserum efter kokning, skall betraktas som EIEC och inte som Shigella.

Det är lämpligt att SMI t.v. handhar den slutliga identifieringen av Shigella då de samlade erfarenheterna vid SMI, i samarbete med internationella referens-laboratorier, kan komma att påverka framtida klassificering av Shigella, och att stammarna då finns tillgängliga för typning.

Avvikelser från referensmetodiken

Referensmetodiken anger en miniminivå för diagnostiken. Avvikelser från referensmetodiken måste valideras mot denna och dokumenteras.

Alternativ diagnostik

Shigella-liknande bakterier, här definierade som både Shigella och EIEC, kan med god säkerhet och med stor känslighet identifieras genom påvisande av virulens¬plasmiden i ett fecesprov. Vid SMI görs detta genom att utodla feces på en MacConkey-platta och därefter analysera utväxta kolonier med PCR.

Resistensbestämning och resistensutveckling

Även om flertalet Shigella-infektioner läker ut spontant antibiotikabehandlas många patienter med god effekt. Behandling förkortar också smittsamhetsperioden. Utveckling av multiresistens har noterats främst i Sydostasien. Shigella-bakterier skall därför resistensbestämmas. Rekommendationen följer aktuell metodik utarbetad av RAF.

Epidemiologisk typning

SMI utför rutinmässigt en begränsad serologisk typning av Shigella. Detta är särskilt viktigt vid misstanke om utbrott och inhemsk smitta. Vid behov kompletteras denna genom typning med bl.a. DNA-baserad metodik.

Kvalitetskontroll och metodkalibrering

Utförs efter de principer som anges under kvalitetssäkring i den allmänna delen

Referensstammar

I tabell 11 listas referensstammar av Shigella

Tabell 11. Shigella referensstammar vid kontroll av substrat och övriga diag-nostiska pro¬ce¬durer.

                                                                                                      Växt på 1)

Bakterie CCUG ATCC Karakteristika XLD DC-Hynes

Shigella flexneri 21 251 indolpositiv >75 >75 Shigella flexneri 32 079 12 022 normalvariant >75 >50 Shigella sonnei 32 351 25 931 normalvariant <25 <25 Shigella sonnei 9567 9774 normalvariant <25 <10 1) Avser relative growth index (uttryckt i procent), d.v.s antal CFU på testagar x100/antal CFU på kontrollagar (CLED eller MacConkey), se också avsnitt substratprövning, bilaga 1.2.

• Referenssera
  • Sh. dysenteriae 1-13 (Reagensia AB)
  • Sh. flexneri (Reagensia AB)
  • Sh. flexneri monoklonaler (Reagensia AB)
  • Sh. boydii 1-18 (Reagensia AB)
  • Sh. sonnei SoR (Reagensia AB)

Svarsrutiner

Svar formuleras enligt laboratoriets rutiner. Vid stark misstanke om Shigella kan ett preliminärsvar om växt av misstänkt Shigella anges, samt att isolatet sänts till SMI för verifiering. Efter erhållet svar meddelas detta till inremitterande med angivande av species samt i förekommande fall serotyp. Resistensmönster mot antibiotika skall bifogas preliminärsvaret.

Laboratorierapportering

Alla fynd av Shigella skall anmälas av laboratoriet enligt smittskyddslagen, Grupp 1.2 Samhällsfarliga sjukdomar på därför avsedd blankett, eller via SmiNet.

REFERENSER

Infektionsmedicin. red Iwarson-Norrby. 1995. Säwe Förlag

Ljungh Å. Bacterial infections of the small intestine and colon. Current Opinion in Gas-troente¬rology. 1998;14:33-44.

RAF; (http://www.srga.org)

Rowe, B & Gross, R.J (1984). I Bergey´s Man Bacteriol” vol 1, 1984;423-427.

Thore, M, Lindman, R. Primär diagnostik av Salmonella, Shigella och Yersinia Standardisering av metoder för testning av fasta substrat. Urval av referensstammar SMI-tryck nr 127-1999.

Wathen-Grady, H.G., Davis, B.R & Morris, G.K. Addition of three new serotypes of Shigella boydii to the Shigella schema. J Clin Microbiol 1985;21:129-132

Wathen-Grady, H.G., Britt, L.E., Strockbine, N.A. & Wachmuth, I. Characterization of Shigella dysenteriae serotypes 11, 12, and 13 J Clin Microbiol 1990;28:2580-2584.