Yersinia enterocolitica och Yersinia pseudotuberculosis

Yersinia enterocolitica och Y. pseudotuberculosis

Smittämnet Yersinia är gramnegativa stavar tillhörande familjen Enterobacteriacae Genus Yersinia föreslogs 1944 och tio år senare placerades detta genus i famil-jen Enterobacteriaceae. Inom genus Yersinia finner man idag elva olika arter (Farmer, 1995):

Yersinia aldovae Yersinia bercovieri Yersinia enterocolitica Yersinia frederiksenii Yersinia intermedia Yersinia kristensenii Yersinia mollareti Yersinia pestis Yersinia pseudotuberculosis Yersinia rodei Yersinia ruckeri

Y. bercovieri och Y. mollareti har tidigare tillhört arten Y. enterocolitica och är svåra att biokemiskt särskilja från Y. enterocolitica.

Primärt humanpatogena bakterier finner man inom arterna Yersinia enterocoli-tica, Y. pestis (orsakar pest som ej beskrivs i denna bok) och Y. pseudotuber-culosis. Den senare har mer än 90 % DNA/DNA homologi med Y. pestis (Ber-covier & Mollaret, 1985) vilket placerar dem inom samma art. Y. pseudotu¬ber-culosis ger dock en annan sjukdomsbild än pest och bakterierna hänförs därför av praktiska skäl till två olika arter.

Gemensam virulensfaktor för patogena Yersinia-bakterier är en plasmid som kodar för ett antal virulensproteiner. Smittskyddslagens sjukdom Yersinia-infektion tolkas följaktligen som infektioner med bakterier tillhörande Yersinia ente¬rocolitica och Yersinia pseudotuberculosis som bär virulensplasmiden. Plasmi¬den är temperaturreglerad och virulensproteiner uttrycks enbart vid 37 °C. Vissa andra metabola egenskaper av diagnostisk betydelse, uttrycks bättre vid lägre temperatur; t.ex. produceras O-antigen bäst vid 28 °C-30 °C och vissa bio¬ke¬miska test som t.ex. VP blir positiva bara vid lägre temperaturer.

Yersinia enterocolitica kan biokemiskt indelas i 6 biogrupper 1A, 1B, 2, 3, 4 och 5 (Bottone 1997) och kan, med avseende på sitt O-antigen, serologiskt hänföras till 78 serogrupper (Fenwick 1996). Primära humanpatogener återfinns endast i ett begränsat antal serogrupper av Y. enterocolitica, i Europa främst O3 och O9 inom biogrupperna 2, 3 och 4. Enstaka isolat tillhörande O5/27 och andra sero¬grupper har beskrivits (Bottone 1997). I Nordamerika förekommer även sero¬grupp O8 tillhörande biogrupp 1B. Hos bakte¬rier tillhörande biogrupp 1A har man hittills inte funnit någon klon med invasiv förmåga. Infektioner med Y. enterocolitica tillhörande biogrupp 1A räknas därför inte som Yersinia-infektion.

Yersinia pseudotuberculosis kan serologiskt indelas i 14 O-grupper med till-sammans 10 undergrupper (Tsubokura 1995). I en tysk undersökning omfat-tande åren 1983 till 1993 hittade man 54 humana in¬fektioner med Yersinia pseu¬dotuberculosis. Av dessa stammar tillhörde 31 O-grupp 1 och övriga O-grup¬perna O2, O3, O5 och O6 (Alecsic 1995). De få stammar som identifierats i Sverige de senaste åren har alla tillhört O-grupp 1.

Patogenes och patofysiologi Infektionsdosen är okänd. Inkubationstiden för Y. enterocolitica är från någon upp till 10 dagar. Bakterierna invaderar tarmslemhinnan och ger därvid upphov till sjukdomssymtom. De förökar sig särskilt i ileum där de förorsakar inflam-mation och eventuellt ulceration av slemhinnan (terminal ileit). Spridning till regionala lymfkörtlar (”körtelbuk”) och mera sällan till blodbanan förekommer.

Symtom och klinisk bild Symtombilden vid infektioner med Y. enterocolitica innefattar feber, buksmärtor och i drygt hälften av fallen, särskilt hos barn, diarré ibland med blod¬tillblandning. Appendicitliknande smärtor före¬kommer ofta samman-hängande med mesenterial lymfadenit. Utdraget sjuk¬domstillstånd över veckor till måna¬der är inte helt ovanligt. Mycket vanliga komplikationer är reaktiv artrit i de stora lederna (upp till 1/3 av fallen, de flesta hos HLA-B27 positiva) något som även förekommer efter asymtomatisk infek¬tion. Erytema nodosum och andra manifestationer från hud, slemhinnor och genitalia ses också. Y. pseudo¬tuberculosis ger upphov till liknande, dock ofta mildare sjukdomsbild.

Inga studier talar för gynnsam effekt av antibiotikabehandling på tarmsymtom. Smittade utsöndrar Y. enterocolitica i feces under ca två veckor upp till fyra månader.

Laboratoriediagnostik Allmänt Alla arter av Yersinia (med undantag av Y. pestis) tillhör skyddsklass 2.

Referensmetodik Referenssubstrat Nedanstående substrat utgör referenssubstrat vid primärisolering av Yersinia enterocolitica och Yer¬sinia pseudotuberculosis från humana fecesprov (recepten återfinns i bilaga 1.1)

Yersinia selective agarbas enligt Schiemann (CIN-agar) [Bilaga 1.1.5]: Jäm¬fört med icke inhibitoriskt kontrollsubstrat växer de flesta stammarna med GI >50 %. Många stammar av Y. pseudotuberculosis växer inom två dygn med samma koloniutseende som Y. enterocolitica.

På XLD- eller Hektoen-agar kan Yersinia-bakterier också växa, men växer då med kolonier av samma utseende som övriga koliforma bakterier. På DC-agar kan Y. enterocolitica växa med typiska små ”gnistrande” kolonier.

Generellt rekommenderas något av de kommersiella halvfabrikat som finns på marknaden. Angående testning av loter och fortlöpande kvalitetskontroll, se bilaga 1.2 substratkontroll.

Isolering Primär utodling: Provmaterial på provtagningspinne stryks ut på CIN-agar och sekundärstryk görs. Plattan inkuberas i 28 °C - 30 °C i ett och två dygn.

Anrikning: se under avsnittet avvikelser från referensmetodiken.

Identifiering och minimikriterier Presumtiv diagnos: Typiskt koloniutseende för Y. enterocolitica är små, cen¬tralt mörkröda och i periferin färglösa kolonier, som växer ut inom ett dygn s.k. bull’s eye. Efter två dygn kan utseendet vara mer svårtolkat. Y. pseudotuber-culosis har ett likartat utseende på CIN-agar, men i de fall bakterierna växer ut sker detta oftast först efter två dygns inkubering.

Slutlig diagnos: En säker identifiering av en invasiv Yersinia med potential att orsaka yersinos kräver förutom en omfattande biokemisk testpanel även att stammen agglutinerar i antiserum samt att virulensplasmiden påvisas. Refe-rensmetod för hur detta skall göras beskrivs nedan. En tränad bakteriolog kan dock med stor säkerhet komma till korrekt diagnos med betydligt enklare test-batteri (se avvikelser från referensmetoden). Misstänkta kolonier plockas och karakteriseras med biokemiskt testbatteri samt renstryks på MacConkey-agar (inkuberas i rumstemperatur, d.v.s. 28 °C - 30 °C, över natt). Resultatet av biokemisk testning avläses och tolkas enligt tabell 12.

Tabell 12. Biokemiska referenssubstrat och förväntade resultat efter inkubering i 28 °C -30 C vid identifiering av Yersinia-bakterier1) ________________________________________________________________

Typiskt för Mannit LD OD H2S ONPG Indol Urea

Y. enterocolitica O3/O9 +/0 gas - + - + - + Y. enterocolitica O8/O9 +/0 gas - + - + + + Y. pseudotuberculosis +/0 gas - - - + - + ________________________________________________________________ 1) Observera att ovanstående biokemiska utfall ej säkert identifierar humanpato¬gena Yersinia-bakterier. Kom¬pletterande tester måste därför utföras (se text).

Om misstanke på Yersinia kvarstår efter utfall enligt tabell 12 utförs agglutina-tionstest i serogrupp-specifikt (O3 och O9) antiserum med bakterier utväxta på MacConkey¬-agar inkuberad i 28 °C - 30 C.

Observera att inget O-antigen produceras vid 37 C. Inte heller VP-reaktionen är positiv vid 37 C.

Oavsett resultatet av agglutinationstestet skall ytterligare identifiering ske med kommersiell analys¬bricka (t.ex. API 20E), vilken inkuberas enligt tillverkarens rekommendationer.

Den kommersiella testbrickan skall kompletteras med test för eskulinhydrolys (om sådan saknas i brickan) t.ex. med ROSCO-tabletter. Patogena stammar av Y. enterocolitica, oberoende av serogrupp, är eskulin- och pyrazinamidas-negativa. Notera att Y. pseudotuberculosis är positiv i eskulin.

I tabell 13 sammanfattas olika utfall av referenstesterna och i tabell 14 anges ytterligare kriterier (ej minimikriterier).

Tabell 13. Utfall av referenstester för diagnostik av humanpatogena Yersinia-bakterier, samt tolkning av re¬sultatet.

Biokemiskt Kommersiell Eskulin- Aggl Tolkning testbatteri analysbricka hydrolys (O3/O9)

Indikerar Y. enterocolitica + - + Y. enterocolitica O3 resp O9

         ” 	       	  +  	    -	     -  	” annan humanpatogen                                                                                                                                       				serogrupp eller ej human¬-

patogen Yersinia, -Reflab

        ”  	  +   	    +	     -	ej humanpatogen Yersinia

         ” 	 +/(-)	   +/-   	     +    	oklart, -Reflab

Y. pseudotuberculosis + + - Y. pseudotuberculosis *

         ”       	   +   	     -  	      -  	oklart, - Reflab 

         ”         	    -  	   +/-  	      -  	ej humanpatogen Yersinia

________________________________________________________________

• SMI tar gärna emot positiva isolat då de är så ovanliga

Slutlig identifiering: I tabell 14 anges ytterligare diagnostiska kriterier för yer-sinosframkallande or¬ganismer. Oklara fall enligt Tabell 13 vilka kan sändas till Referenslaboratorium testas där med detta batteri. Testerna kan givetvis också utföras på de enskilda laboratorierna

Tabell 14. Identifiering av agens motsvarande smittskyddslagens yersinos VP 22 °C VP 37 °C Rham-nos Sali- cin Meli-bios Sacka-ros AA* 22 °C AA 37 °C ** Pyz Oxi-das YE O3 + - - - - + - + - - YE O9 + - - - - + - + - - YE 5/27 mm + - - - - + - + - - Y. pseudo - - + +/- + - - + -

• Autoagglutination, kan ersättas av specifik PCR ** Pyrazin amidas-test

Avvikelser från referensmetodiken Referensmetodiken anger en hög ambitionsnivå för diagnostik av patogena Yer¬sinia. I det praktiska arbetet på ett rutinlaboratorium kan diagnosen Yersinia enterocolitica O3 och O9, av en tränad bakteriolog, oftast ställas med betydligt färre biokemiska tester och utan att påvisa virulensplasmiden. Viktigt är då att man har gjort en jämförande studie som visar att de förenklingar som gjorts inte negativt påverkar specificiteten av diagnostiken.

Kommersiell selektiv peptonbuljong (t.ex. Yersinia selective enrichment broth acc. to Ossmer) kan användas för anrikning, men uppgift saknas över metodens effektivitet. Det är också acceptabelt att använda selektivt Yersinia agarsubstrat enligt Wauters [Bil. 1.1.6]. För primärisolering av Yersinia pseudotuberculosis kan MacConkey-agar utgöra ett komplement. Autoagglutination kan ersättas med specifik och utvärderad molekylärgenetisk metod (t.ex. PCR) för att påvisa virulensplasmiden. Odling i 22 °C och 28 °C-30 °C kan normalt ersättas med od¬ling i rumstemperatur.

Alternativ diagnostik Ingen alternativ diagnostik finns för närvarande tillgänglig för humana feces-prov. Diagnosen Yersina-infektion kan efter en infektion med serotyp O3 även ställas med serologi. Känsligast är en ELISA baserad på lipopolysackarid vilken används vid vissa laboratorier. Serologiska tester som använder avdödade bakte¬rier som antigen finns också.

Epidemiologisk typning Utöver serotypning saknas etablerad metodik för epidemiologisk typning.

Kvalitetskontroll Metodkalibrering förväntas ske efter de principer som skisseras under avsnittet kvalitetssäkring i allmän del.

Referenstammar:

Tabell 15. Lista över Yersinia-stammar som utgör referensstammar vid kontroll av substrat och övriga diagnostiska procedurer: ________________________________________________________________

                                  	                                                                    Växt på 1)

Bakterie CCUG ATCC Karakteristika CIN

Y. enterocolitica O3 8 233 Normalvariant, indol- >50

        ”         O8 	33 055	27 729	”           , indol-  	>10
        “         O9    	82 39A    		”           , indol+ 	>50

Y. pseudotuberculosis 17 342 >25 2) ________________________________________________________________ 1) Avser relative growth index (uttryckt i procent), d.v.s. antalet CFU på test¬agar x100/antalet CFU på kontroll¬agar (CLED eller MacConkey), se Bilaga 1.2 sub¬strat-prövning. 2) Efter 2 dygns inkubering.

Referensserum: Yersinia O3 och O9 (Reagensia AB)

Resistensbestämning och resistensutveckling Inga studier talar för gynnsam effekt av antibiotikabehandling på duration av tarmsymtom. Ut¬dragna eller komplicerade infektioner kan behandlas med doxy¬cyklin eller fluorokinoloner, dock med osäker effekt på uppkomsten av reaktiv artrit. Septisk Yersinia-infektion behandlas med fluorokinoloner, trim/sulfa eller senare generationer av cefalosporiner.

Svarsrutiner Svar formuleras enligt laboratoriets rutiner. Det skall observeras att vissa stam-mar av Y. enterocolitica inte betraktas som humanpatogena (se inledningen). Flertalet sådana icke humanpatogena stammar har hittills visats vara eskulin-positiva. Därför har testning för eskulinhydrolys medtagits i referensmetodiken.

Laboratorierapportering Yersinia-infektion skall anmälas av laboratoriet enligt smittskyddslagen övriga anmälningspliktiga sjukdomar, grupp A2, på därför avsedd blankett eller via SMInet. REFERENSER: Alecsic, S., Bockemühl, J. & Wuthe, H-.H. Contrib Microbiol Immunol 1995;13:55-58. "Yersinosis: Pre¬sent and future."

Bercovier, H. & Mollaret, H. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol 1,1985;498-506.

Bottone, E. J. Yersinia enterocolitica: The carisma continues. Clin Microbiol Rev 1997;10:257-276.

Farmer III, J. Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. 1995;438-449.

Fenwick, S.G., Wauters, G., Ursing, J. & Gwozdz, M. Unusual Yersinia entero¬colitica strains recovered from domestic animals and people in New Zealand. FEMS Immunol Med Microbiol 1996;16:241-245.

Infektionsmedicin. red Iwarson-Norrby. 1995. Säwe Förlag

Ljungh, Å. Bacterial infections of the small intestine and colon. Current Opinion in Gas-troente¬rology. 1998;14:33-44.

RAF (www.srga.org)

Thore, Lindman, Primär diagnostik av Salmonella, Shigella och Yersinia Standardisering av metoder för testning av fasta substrat. Urval av referens¬stammar. SMI-tryck 127, 1999.

Tsubokura. M.& Alecsic, S. "Yersinosis: Present and future." Contrib Microbiol Immu¬nol 1995;13:99-105.

Wauters, G., Alecsic, S. & Schultze, G. "Current investiga¬tions of the micro¬biology of yersiniae." Contrib. Microbiol. Immunol. 1991;12:239-243.