Tuberkulos och mykobakterios-laboratoriediagnostik

Huvudartikel: Tuberkulos

och

Atypiska mykobakterier

---

Laboratoriediagnostik av tuberkulos och mykobakterios

Allmänt

Odling är referensmetod. Det är viktigt att erhålla isolat för resistensbestämning och epidemiologisk typning. Odling av tuberkelbakterier kräver tillgång till säkerhetslaboratorium klass III enligt gällande föreskrifter från Arbetsmiljöverket.

Referensmetodik

Odling

Odlingsförfarandet är utformat så att växt av både MTB och NTM gynnas.

• Referenssubstrat: Löwenstein-Jensen (LJ) äggbaserat fast medium med glycerol eller natriumpyruvat (se Tuberkulos-Bilaga 6). För flytande odling finns kommersiella Middlebrook-buljonger av typ Bactec 7H13A.

• Homogenisering, dekontamination och koncentrering: Prov som normalt är kontaminerade med normalflorans snabbväxande bakterier (t.ex. sputum) dekontamineras och digereras med nariumlaurylsulfat och natronlut enligt nedan. Ev. tillsätts 200 mg acetylcystein/mL för bästa slemupplösning.

• Natriumlaurylsulfatbehandling
  • 1. För över upp till 2 mL prov till ett 10 mL centrifugrör.
  • 2. Tillsätt 3 mL 3 % natriumlaurylsulfat.
  • 3. Skaka röret 3 ggr med Vortex under 20 min.
  • 4. Centrifugera vid minst 3000 x g 20 min.
  • 5. Spara pellet inklusive 0,5 mL vätska.
  • 6. Neutralisera till gult omslag med 0,09 % svavelsyra med bromkresolpurpur.
  • 7. Tvätta ev. med ca 10 mL PBS om så behövs för fortsatta laborationer. Centrifugera då vid 3000 x g 15 min.

I fall då centrifug för 50 mL rör finns är det fördelaktigt att öka provmängden och justera tillsatserna i enlighet med den faktiska volymen prov. (Reagens se Tuberkulos-bilaga 6).

Undvik förlängd expositionstid för lut, viabiliteten hos mykobakterierna kan minska.

• Kontaminerade prov i större mängd (t.ex. urin, ventrikelsköljvätska): Proven bör centrifugeras, helst i 50 mL rör. Om detta ej är möjligt kan sedimentering i kylskåp 12-24 tim ge en viss anrikning av bakterier. I vissa fall kan t.ex. 5 x 10 mL rör användas.

Från bottensatsen överförs 1-2 mL till centrifugrör, varefter natriumlaurylsulfatbehandling utförs enligt ovan.

• Kroppsvätskor från normalt sterila lokaler (t.ex. pleuravätska). Om viskösa: natriumlaurylsulfatbehandling enl ovan.

Vid stora mängder bör centrifugering ske före odling och ev. behandling. Om provet misstänks vara kontaminerat odlas över natt på hematinagar och ev. laurylsulfatbehandling om osterilt.

• Vävnad, biopsier.
  • 1. Provet homogeniseras i steril mortel.
  • 2. 1 mL PBS tillsätts.
  • 3. Skakas i Vortex.
• Blod: För ändamålet avsedda buljongflaskor inokuleras med blod av provtagaren.
• Benmärg: Ingen förbehandling. Koagel homogeniseras i mortel.

Isolering

0,3-0,5 mL av provmaterialet inokuleras på två LJ-rör, ett med glycerol och ett med natriumpyruvat som kolkälla. Till ett rör sätts vid behov en lämplig antibiotika¬kombination för att undertrycka kontaminerande flora, t.ex. PANTA (Becton Dickinson). Inkubation sker under 7 veckor i 37 C.

Prov från ytliga lokaler (körtelbiopsi, sår, hud) inkuberas på ytterligare två rör enligt ovan, och inkuberas i 30 C (för växt av M. marinum och M. ulcerans).

Prov från normalt sterila lokaler inkuberas i Middlebrook-buljong. I sådana fall måste laurylsulfatbehandlat material sköljas med PBS (se ovan) då växten i buljong hämmas av laurylsulfatet.

Blod/benmärg inokuleras i blododlingsbuljong, upp till 5 mL av provet. Supplement som tillhandahålls av tillverkaren tillsätts på laboratoriet. Lymfocyter i blodet kan ge ett visst utslag som om växt skulle förekomma i buljongen.

Feces. Två droppar extra antibiotikalösning (PANTA) kan droppas på substratet för att hindra kontamination.

Avläsning

LJ-rör inspekteras minst varje vecka under 7-8 veckor. Preparat görs från misstänkta kolonier för auraminfärgning.

Koloni¬morfologin varierar mellan arterna och inom art beroende på tillväxtbetingelserna från ‘smooth’ till ‘rough’. Kolonierna kan vara opigmenterade (från svagt gulvita) till beige, gula och mera sällan skära till orange. Pigment kan bildas i mörker (skotokromogena) eller endast vid belysning (fotokromogena). Tillväxten är långsam med generationstider 2-20 tim. Synliga kolonier kan observeras efter ca 2-7 dagar (snabbväxare) eller 10 dagar - 8 veckor (långsamväxare). Optimal temperatur för tillväxt varierar från 30 C (M. marinum, vissa M. avium) till 45 C (M. xenopi). De flesta arter växer på Middlebrook-buljonger eller äggsubstrat (Löwenstein-Jensen), vissa kräver tillsats av hemin, mykobaktiner eller andra tillväxtfaktorer.

Buljongodlingssystem som BACTEC, MGIT och BacT/Alert bygger på olika principer för (automatisk) detektion av mykobakterieväxt. De moderna systemen rapporterar direkt till centraldator samt larmar vid positiv växt. Inkubation under 6 veckor är standard. Alla tre systemen detekterar på ett fullgott sätt växt av mykobakterier förutsatt att laurylsulfat från förbehandling avlägsnats från provet.

Identifiering och minimikriterier

Mycobacterium tuberculosis-komplexet

Växt av cordbildande syrafasta bakterier på Löwenstein-Jensen-substrat eller Middlebrook-buljong. Positiv DNA-hybridisering (>60 000 RLU) med MTB-komplexet-probe (Accuprobe, Gen Probe).

M. tuberculosis är normalt in vitro resistent mot tiophen-2-carboxylsyrahydrazid (TCH) 5 mg/L och känslig för pyrazinamid, även om avvikelser (TCH =S) eller (PZ = R) förekommer.

M. bovis är alltid TCH-känslig och PZ-resistent. M. bovis-BCG fordrar molekylär typning för säker diagnos.

Konfirmering av M. bovis och BCG kan ske med spoligotypning (Smitt¬skydds-institutet). Diagnostiskt kit, som med omvänd hybridisering kan påvisa M. bovis, M. bovis-BCG, M. africanum I m.fl. från renkultur finns på marknaden, men är ännu ofullständigt utvärderat (Genotype, Hein GmbH).

M. avium-intracellulare-komplexet (MAC)

Växt av icke-cordbildande syrafasta bakterier på Löwenstein-Jensen- eller Middlebrook-substrat. Positiv DNA-hybridisering (> 60 000 RLU) för MAC med Accuprobe (Genprobe). Övriga icke-tuberkulösa mykobakterier. Artbestämning sker, främst med molekylära metoder, vid hänvisningslaboratorium.

Alternativa diagnostiska metoder

Mikroskopi

Auramin¬färgning med fluorescens används vanligen för både sputummikroskopi och undersökning av kulturer. Färgen kan inte avlägsnas med syra-alkohol, vilket gett upphov till beteckningen ‘syrafasta bakterier’. Ziehl-Neelsen-färgning är ett alternativ, som möjliggör avläsning i vanligt ljusmikroskop. Det går lättare och snabbare att upptäcka bakterierna med fluorescensmetoden. Syrafastheten kan delvis gå förlorad i vissa faser av tillväxt, och är inte sällan partiell på snabbväxande icke-tuberkulösa mykobakterier.

Mikroskopisk undersökning av sputum är en snabb, enkel och säker diagnostisk metod. Det krävs ca 104 mykobakterier per mL sputum för positivt resultat, varför mikroskopi ensamt inte är tillräckligt känslig för diagnostik av mykobakterie-infektion, utan denna bör alltid kompletteras med odling.

Smittsamhetsbedömning görs med mikroskopi av icke anrikat sputum, och är naturligen av störst intresse före behandling, men kan också ge indikation på återfall om bakterieantalet ökar kraftigt under behandling. Sensitiviteten jämfört med odling är ca 25 % om icke anrikat sputum används och ca 50 % om sputum förbehandlas och centrifugeras. Specificiteten är vanligen > 99 % men kan sjunka vid < 15-25 mikroskopier per vecka.

Man kan inte med mikroskopi differentiera mellan M. tuberculosis-komplexet och NTM. Det är fördelaktigt att utföra PCR för MTB vid fynd av syrafasta bakterier i luftvägssekret för att klarlägga arten infektiöst agens, TB eller NTM. Positiv mikroskopi kombinerat med negativ PCR för MTB skall tolkas som NTM-infektion.

OBS att mikroskopi på BAL inte ger tillförlitlig smittsamhetsbedömning, den bör göras på sputum. OBS att utanför tbc-lab framställda glas för mikroskopisk undersökning av mykobakterier ej bör mottagas då kvaliteten kan vara undermålig. OBS att risken för kontamination av provet med ovidkommande mykobakterier bör beaktas. Källor för kontamination kan vara t.ex. kranvatten, (M gordonae m.fl.), färgvätskor och immersionsolja.

• Homogenisering av prov: Prov bör homogeniseras och koncentreras med centrifugering >3000 x g för att öka sensitiviteten av mikroskopi och odling. Viskösa prov görs flytande genom behandling med t.ex. natriumlaurylsulfat och acetylcystein (se nedan under primärisolering).

• Utstryk och fixering: Utstryk prepareras på vanligt sätt och fixeras genom upphettning i 80 C 2 timmar eller med gaslåga.
• Fluorescensfärgning med auramin: Fixerade preparat inkuberas i 0,3 % auraminlösning 15 min i kuvett med lock. Skölj med kranvatten. Avfärga med syra-alkohollösning 10-15 min. Skölj med kranvatten.

Kontrastfärga med 0,5 % natriumpermanganat i vattenlösning 30 sek, skölj med vatten. Låt preparaten lufttorka ev. i termostat. Reagens se Tuberkulos-bilaga 6.

För färgning används väl rengjorda kyvetter. Preparat från kulturer blandas ej med dem för sputummikroskopi för att minimera kontaminationsrisken.

Auramin står på Arbetsmiljöverkets lista över carcinogena ämnen. Lösning i koncentration < 1 % får användas utan tillstånd men skall hanteras med försiktighet. Använd handskar och undvik hudkontakt. Kontaminerade kläder tas omedelbart av och exponerade hudpartier sköljs med rikligt vatten. Spill i lokalen skall saneras. Kontaminerat avfall samlas i papperspåsar för destruktion. Använd auraminlösning hälls i särskild flaska som går till destruktion via riskavfallstransport. Kärl innehållande auraminlösning hålls väl tillslutna och märks ”cancerrisk”.

Avläsning

Screening av preparatglas kan ske vid lägst 250 x med okular x10-12. UV- eller blåljus från 50w Hg-lampa med BG 12 primärfilter används för auramin. Granska minst 35 synfält. Använd större förstoring för att identifiera misstänkta mykobakterier (”beading” i MTB, se t.ex. ASM-manual).

Kvalitetskontroll

En standardiserad preparatkontroll inkluderas vid varje färgningstillfälle. M. gordonae eller annan apatogen art rekommenderas.

Molekylärbiologiskt påvisande

Direktpåvisning av M. tuberculosis-komplexet med polymeraskedjereaktionen, PCR, eller liknande molekylärbiologiska metoder, har etablerats som viktiga snabb¬diagnostiska metoder, särskilt av lungtuberkulos. Sålunda visades redan 1993 med PCR sensitivitet 83 % och specificitet 99 % gentemot odling för luftvägsprov. Liknande siffror har redovisats från Norden. Samma metoder kan användas för serösa sekret och även vävnadsprov. Särskilt i de senare är bakteriemängden ofta låg och inhibitorer kan störa reaktionen, varför sensitiviteten är relativt låg.

Eftersom bakterier som är döda eller har nedsatt viabilitet kan påvisas med PCR kan odlingsnegativa prov vara sant PCR-positiva. Stabiliteten hos DNA möjliggör detektion av tuberkelbakteriers DNA i formaliniserade prov och även i t.ex. luftvägsprov flera månader efter insatt tuberkulosbehandling.

PCR görs på alla mikroskopipositiva prov, men också på begäran av klinikern, samt på alla likvorprov (OBS 5 ml likvor fordras för optimal diagnostik!). Prov under terapi är ej indicerat. Sensitiviteten för luftvägsprov är 90 % jämfört med odling, för vävnad, sekret och exkret 50-60 %. Specificiteten är 99-100 %. Negativ PCR utesluter således ej tbc! Inhibitorer i sekret och vävnader kan minska sensitiviteten i PCR. Sköljning av materialet med PBS kan avlägsna inhiberande substanser. Även i likvor finns inhibitorer varför spädning och centrifugering bör ske.

PCR-tekniken är krävande trots att utmärkta kits finns på marknaden. Strikta rutiner för att hindra kontamination av laboratoriet med den aktuella genetiska sekvensen är av största betydelse. Om kontamination inträffar tvingas man oftast byta till annan teknik. PCR bör endast utföras i laboratorier som har resurser för samtidig myko¬bakterieodling, så att kontinuerlig jämförelse av resultaten kan ske. Slutlig bakteriologisk diagnostik med differentiering inom M. tuberculosis-komplexet kan för närvarande inte ske utan odling. Resistensbestämning sker heller vanligen inte utan odling (undantag molekylärbiologisk påvisning av rifampicinresistens - rpoB-genen). Med risk för förekomst av resistent M. tuberculosis bör odling och resistensbestämning aldrig underlåtas på fall av misstänkt tbc.

Resistensbestämning

Resistensbestämning av MTB-komplexet

Vilda stammar av MTB som inte mött något tbc-läkemedel är konstanta i sin känslighet för dessa. Dock föreligger en mutationsfrekvens på 10 7- 10 8, olika för olika medel. Resistensutveckling i bakteriologisk mening uppkommer genom selektionstryck vid inadekvat terapi, varvid den resistenta bakteriepopulationen snabbt kommer att dominera. Därför måste kombinationsbehandling ges. Kombinationen av två medel mot vilka mutationsfrekvenserna för resistens är 107 och 108 ger en summationseffekt = 1015, varvid mutation för båda medlen blir så sällsynt att den saknar klinisk betydelse.

Samlad klinisk erfarenhet av tbc-behandling har visat att denna blir effektiv om frekvensen resistenta mutanter i bakteriepopulationen understiger 1 % för vart och ett av de ingående medlen. För praktiskt bruk tillämpas därför gränsen 1 % vid in vitro resistensbestämning för tuberkulostatika. Följande medel är förstandsval: streptomycin, isoniazid, etambutol, rifampicin, pyrazinamid. Om resistensbestämning mot andrahandsmedel utom amikacin och ofloxacin, eller tredjehandsmedel och andra ovanliga substanser önskas, bör detta ske på landets referenslaboratorium, SMI.

• Proportionsmetoden: Denna metod mäter om proportionen resistenta/känsliga TB-bakterier är >1 % eller <1 %. Om den är >1 % anses resistens föreligga, om <1 % är stammen att anse som känslig. Proportionsmetoden utförs vanligen på 7H10-agar med läkemedel tillsatt i relevanta koncentrationer, och är av WHO accepterad referensmetod.

Proportionsmetoden med BACTEC-teknik för MTB-komplexet. Bactec-systemet (Becton Dickinson) har i många undersökningar givit resultat i resistensbestämning likvärdiga med standard-proportionsmetoden. Detektion av bakterieväxt sker genom påvisning av från substratet frigjord 14CO2. Metodiken är snabb och känslig för påvisning av mykobakterier och för resistensbestämning.

Mediet är flytande Middlebrook 7H9 anrikat med albumin, katalas, kasein och 14C palmitinsyra; pH är 6,8 utom för pyrazinamid där det är 6,0. Slutkoncentrationen isoniazid är 0,1 (och 1,0 mg/L), rifampicin 2,0, etambutol 5,0 och pyrazinamid 100 mg/L (amikacin 1,0 och ofloxacin 2,0 mg/L). Varje flaska med läkemedel samt en kontrollflaska inokuleras med en standardiserad bakteriesuspension, dessutom en kontrollflaska med spädning 1/100. Inokulatet kan beredas direkt från kolonier på fast medium, men även direkt från växande kultur i flytande medium, (Se BDs manual). Det är viktigt att inokulaten är exakt avvägda då för stora inokulat kan ge falsk resistens. Nefelometer rekommenderas för kontroll av bakteriesuspensionens täthet. Tolkningen baseras på den dagliga förändringen i tillväxt.

Skillnad vid optimal växt (dag 3-4) i GI hos 1/100 spädningen av kontroll > skillnaden i GI hos ett läkemedel indikerar att stammen är känslig. Om skillnaden i tillväxt hos 1/100 kontrollen < skillnaden i GI hos ospädd suspension med ett läkemedel indikerar detta att stammen är resistent. I sådana fall rekommenderas att resistensbestämningen upprepas. Tolkningsmallar finns i BDs manual.

Här erinras om att bovina stammar är naturligt resitenta mot pyrazinamid.

Resistensbestämning av NTM

• Resistensbestämning av långsamväxande NTM med BACTEC. NTM har ett begränsat spektrum av känslighet mot antimykobakteriella medel. Resistensbestämning av NTM bör endast göras om terapi planeras. Det är inte självklart att alla funna NTM skall behandlas. Vid fynd av NTM i luftvägarna kan man t.ex. välja avstå behandling hos patienter med begränsade symtom och hög ålder. NTM i halslymfkörtlar hos barn behandlas parktiskt taget aldrig med antimykobakteriella medel.

BACTEC-systemet används för resistensbestämning av långsamväxande NTM när så är påkallat. Tekniken är inte lika väl förankrad i den kliniska verkligheten som resistensbestämningen av förstahandsmedlen mot MTB, varför resultaten bör ses som en riktningsangivelse för terapin. En framgångsrik terapi bör t.ex. inte ändras p.g.a. att stammen befinns vara resistent mot ett av de ingående medlen. Synergism in vitro kan ofta påvisas mellan etambutol och t.ex. rifampicin och/eller ofloxacin på MAC-stammar, vilket antyder att hela behandlingen bör bedömas och inte enbart varje medel för sig. NTM-stammar späds vanligen 1/10 jämfört med MTB-komplexets bakterier, för övrigt samma metodik som för MTB. Det är särskilt viktigt att inokulaten är exakta, annars kan otillförlitliga resultat erhållas. Denna typ av resitensbestämning bör ej utföras av laboratorier som har lågt antal NTM-stammar eller eljest har begränsad erfarenhet av tekniken.

• Resistensbestämning av snabbväxande NTM med Etest. Etest kan användas för resistensbestämning av snabbväxande NTM (M. chelonae, M. fortuitum) men metodiken är inte fullt internationellt accepterad, och korrelationen mellan in vitro fynd och in vivo effekt är inte helt klarlagd. Följande medel rekommenderas för undersökning: Amikacin, ofloxacin, klaritromycin, rifampicin, cefoxitin, doxycyklin, imipenem, trimetoprim-sulfa. Etambutol saknar i allmänhet effekt på snabbväxande NTM.

Epidemiologisk typning

Molekylärepidemiologisk typning med RFLP (restriktions-fragment-längd-polymorfism) av Mycobacterium tuberculosis-komplexet sker för att kartlägga smittkedjor och uppkomna kluster av tuberkulosfall. För detta sänds väl utvuxna förstagångsisolat från varje patient på fast substrat till Smittskyddsinstitutet. (Ev. omstickning på SMI fördröjer analysen ca 4 v.).

Isolat erhållna vid behandligssvikt, recidiv eller befarad reinfektion bör också undersökas. Förutom patientens ID, provtagningsdatum, och provets ID, bör även provmaterial, resultat av mikroskopi och resistensbestämning meddelas, enklast genom att skicka med en kopia av laboratoriets slutsvar.

Resultaten av RFLP för ett isolat redovisas som graden av identitet (ID) med den befintliga RFLP-databasen eller med ett givet prov:

• 100 % ID: stammarna tillhör ett kluster, epidemiologiskt samband är sannolikt.
• >90 % ID: epidemiologiskt samband kan inte uteslutas.
• <90 % ID: unikt mönster, inget epidemiologiskt samband.

Vid förekomst av < 5 band i RFLP kompletteras undersökningen med spoligotypning. Vid identiskt spoligotypningsmönster rapporteras att stammarna tillhör ett kluster.

Information om RFLP-resultat meddelas till:

• Insändande laboratorium,
• SMI epidemiologiska enheten, som meddelar
• vederbörande smittskyddsläkare,
• som kontaktar vederbörande kliniker i fall av klusterbildning.

Om flera smittskyddsläkare involveras samordnar Statsepidemiologen utredningen.

Kvalitetskontroll

• Referensstammar:
  • M. tuberculosis ATCC 27294,
  • M. bovis ATCC 19210,
  • M. avium ATCC 25291.

BCG, stam Copenhagen, BCG-vaccin, Statens Serum Institut, se FASS För icke-tuberkulösa mykobakterier rekommenderas att alla arter som resistensbestäms åtföljs av en ATCC-stam av samma art.